(Normal östrus siklusu esnasında gonadotropin aracılı folliküler gelişim sonrasında periferik serumda ve overlerdeki inhibin A ve total inhibinin değişiklikleri – 1995 – J. Endocrinology)

Daha önceden bildirilmiş olan iki yönlü IRMA’nın son modifikasyonları gebe koyunların serum gonadotropini (PMSG) ile muamele edilen immatür dişi ratlarda ve yetişkin ratlarda 4 günlük östrus siklusu boyunca inhibin A’nın (alfa-beta (A) dimer) serum/palzma konsantrasyonlarının ve over içeriğinin ölçümüne olanak vermiştir. Kıyaslamak için, total alfa inhibin düzeyleri alfa subunitine yönlendirilmiş inhibin RIA ilede ölçülmüş ve en az 10 kat daha fazla (her iki assayin kalibrasyonu için kullanılan 32 kDa’lık aynı sığır inhibin standardına göre ) bulunmuştur. İmmatür dişi ratlarda, inhibin A dimerinin serum düzeyleri ve total a inhibini PMSG enjeksiyonundan sonraki 3 saat içinde artmış ve sonraki 48 saat boyunca enjeksiyon öncesi düzeylere göre 4-5 kat daha yüksek değerlerde seyretmiştir.

Ooferektomi hem inhibin A dimeri hem de total a inhibininde hızlı ve paralel bir düşüşe neden polmuştur; başlangıçtaki yarı öçmürler (+/- %95 güvenlik intervalleri) sırasıyla 22+/-4 ve 20+/-5 dakika olmuştur. Yetşkin ratlarda 4 günlük östrus süklusu esnasında inhibin A dimerinin plazma konsantrasyonların ve over içeriğinde ve total alfa in hibininde belirgin dalgalanmalar ortaya çıkmıştır (en belirgin olarak pro-östrus sabahı ile östrus sabahı arasında) inhibin A dimerinin plazma düzeyleri ve total alfa inhibin pro-östrus dönemi öğleden sonrasında (preovulatuvar gonadotropin zirvesinden hemen önce zirve yapmıştır. Ovulasyondan sonra, hem inhibin A dimeri hem de total alfa inhibin ani olarak düşerken (östrusda 02:00 da 2-3 kat; p>0.001), FSH östrusda 07:00’da zirve yapan sekonder bir yükseliş göstermiştir. IRMA ve RIA kökenli inhibin değerleri 4 günlük siklus boyunca genellikle benzer bir patern izlemişlerse de (plazma: r=0.52; p<0.001; over: r=0.41;p<0.001), östrusda 07:00’da plazma ve over inhibin B dimerinde geçici bir yükselme saptanmıştır (bunatotal alfa inhibinin yükselişi eşlik etmemiştir). Plazma inhibin-A dimerinin bu yükselişi post-ovulatuvar FSH zirvesinin sonlanmasından muhtemelen sorumluydu, çünkü sonraki 15 saat boyunca FSH düzeyleri devamlı olarak azalmıştır. Genel olarak bütün siklus boyunca plazma inhibin_A dimeri ve FSH konsantrasyonları negatif olarak ilişkili iken (r=-0.22; P<0.01), total alfa inhibin ile FSH arasında korelasyon bulunmamıştır (r=-0.11; P=0.12).

 

9

 

Good T.E.M, weber, P.S.D., Ireland, J.L.H., Pulaski, J., Padmanabhan, V., Schneyer, A.L., Lambert-Messerlian, G., Ghosh, B.R., Miller, W.L., Groome, N. and Ireland, J.J. (1995) Isolation of nine different biologically and immunologically active molecular variants of bovine follicular inhibins. Biol. Reprod. 53, 1478-1488. 

(Sığır folliküler inhibinlerinin biyolojik ve immunolojik olarak aktif dokuz farklı moleküler varyantının izolasyonu – 1995 – Biol. Reprod.)

0.675 L’lik sığır follikül sıvısından (bFF) 0.36-4.65 mg’lik dokuz farklı moleküler formdaki inhibini (pro alfa-C-29kDa; tamamen işlenmiş 34kDA; ve büyük inhibin formları 49, 53,58,77,88,110 ve >160 kDa) eş zamanlı olarak izole etmek için immünoafinite kromatografisi, SDSPAGE ve elektroelüsyon’nun bir kombinasyonu kullanıldı. Pro alfa-C dışında herbir inhibin formu immünoblood analiz esnasında inhibin alfa-C 1-26 ve beta A 82-114- subunite yönlendirilmiş antikorlarla çapraz reaksiyon gösterdi. İnhibin formları 22,29,49,veya 58kDa alfa subunitleri ve 17 veya 58 kDa b subunitlerinden oluşmaktaydı. Koyun hipofiz hücre kültürleri esnasında herbir inhibin formunun 5 ng/ml’lik dozu (pro alfa-C haricinde) FSH’nın bazal akümülasyonunu %30-50 baskıladı ancak GnRH aracılı LH salınımını %30-248 artırdı. Çeşitli inhibin formları homolog ve heterolog RIA’lar sırasında ortaya çıkan standart eğrilere paralel şekilde çapraz reaksiyon gösterdi ancak belirigin olarak afrklı rölatif immunopotenslere sahiptiler. RIA’larda pro alfa tamamen işlenmiş inhibin fprmuna göre 3-18 kat daha fazla çapraz reaksiyon gösterdi. İki-yönlü dimer-spesifik ELISA’da inhibinin tamamen işlenmiş ve 7 farklı büyük formu farklı rölatif immunopotenslere sahip olacak şekilde çapraz reaksiyon gösterdi.

Şu sonuca vardık: 1) pFF’den immünoafinite ekstarksiyonu, SDS-PAGE ve elektroelüsyonun kombinasyonu immünolojik ve biyolojik olarak aktif olan 9 farklı moleküler inhibin formunun oldukça zenginleştirilmiş preparatlarından göreceli olarak büyük miktarlarda izole edilmesini sağladı; 2)sığır inhibininin 8 farklı dimerik formu hipofiz glandından hem bazal FSH hem de GnRH aracılı LH sekresyonunu regüle edebilir; 3)inhibinin 8 veya 9 farklı moleküler formu iki-yönlü dimer spesifik assay veya RIA’larda farklı rölatif -immünopotenslere sahip olacak şekilde çapraz reaksiyon göstermektedir.

10

 

Groome, N.., Illingworth, P.J., O’Brien,M., Cooke, I., Ganesan, T.S., Baird, D.T. and McNeilly, A.S. (1994) Detection of dimeric inhibin troughout the human menstrual cycle. Clin. Endocrinol. 40, 717-723.

(İnsan menstrüel siklusu boyunca dimerik inhibinin saptanması – 1994 – Clin. Endocrinol.)

AMAÇ Plazmada dimerik inhibinin ölçümü için iki yönlü bir immunoassay geliştirdik ve geçerliliğni sağladık ve sonrasında normal kadın menstrüel siklusu boyunca dimerik inhinin düzeylerini ölçtük.

DÜZEN Plazma örneklerine eklenen rekombinan inhibin hem folliküler hem de luteal fazda kantitatif olarak elde edildi ve örneklerin seri dilüsyonları 32 kDa’lık rekombinan inhibinin benzer solusyonlarına paralel olarak test edildi. Menstrüel siklus boyunca dört kadından günlük örnekler alınara test edildi.

HASTALAR (a) 6 kadından oluşan 4 grup: (i) normal menstrüel siklusun folliküler fazında olan, (ii) normal mensrüel siklusun luteal fazında olan, (iii) postmenapozal, (iv) superovulayon indüksiyonu için hMG alanlar; (b) 25-33 yaşlarında 4 sağlıklı kadın gönüllü.

BULGULAR Postmenapozal kadınlarda inhibin 2 ng/l’den daha az iken, menstrüel siklus esnasında hMG ile tedavi edilmiş 6 kadın yaklaşık 1125 ng/ldimerik inhibin konsantrasyonlarına sahipti. Bu önceki inhibin assay’lerinde gözlenene benzemekteydi, ancak değişikliğin boyutu belirgin olarak daha fazlaydı.

ÖZET İnsan overi (özellikle korpus luteum) önemli düzeyde dimerik (ve böylece biyolojik olarak aktif) inhibin salgılamaktadır. Erken folliküler faz esnasında, menstrüasyonun başlangıcında oldukça düşük düzeylerde dimerik inhibin bulunurken (3.4 ng/l (Cl 2.2-5.0)), geç folliküler fazda dimerik inhibin konsantrasyonund abelirgin artış vardı. Orta luteal fazda, dimerik inhibin konsnatrasyonu maksimum düzeydeydi (65.6 ng/l (Cl 53.1-81.1)).

 

11

 

Groome NP., Illingworth, P, O’Brien, Measurement of circulating dimeric inhibin-B in the human menstrual cycle using a new ultrasensitive ELISA. J. Clin.Endocrinol. Metab. 81, 1401-1405.

Groome, N.P., Illingworth, P, O’Brien, M., Priddle, J. And McNeilly, A. (1995) A novel ultrasensitive two-site ELISA for the detection of inhibin pro-alpha C-Like immonoreactivity in human serum.J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:2926-2932.

İnhibin alfa subunitinin prekursor formları insan folliküler sıvısında ve muhtemelen plazmada bol miktarda olmasına rağmen, bunların fonksiyonları belli değildir. Alfa subunitinin hem pro hem de alfa C bölgelerin içeren inhibin formlarını ölçmek için yeni bir ELISA’nın gelişimini tanımlıyoruz. Bu assay’in saflaştırılmış insan pro alfa C’si için 0.5 pg/mL’lik bir saptama limiti vardır ve inhibin, aktivin ve follistatinin rekombinan formları ile %0.002’den daha az çapraz reaksiyon göstermektedir. Sodyum dodesil sulfat- poliakrilamid jel elektroforezi ve folliküler sıvı ekstrelerinin immunoblotting’i, bu assay’in hem serbest alfa-subunit hem de intakt dimerik inhibinin pro-içeren prekürsör formlarını saptayabildiğini gösterdi. Normal erkeklerde (446 +/- 28 pg/mL), postmenapozal kadınlarda ((45.8 +/- 3.8 pg/mL) ve in vitro fertilizasyondan önce FSH ile tedavi eilen kadınlarda (1827 pg/mL) serum konsnatrasyonu ölçüldü. Toplanan insan folliküler sıvısı içinde 488 ng/mL vardı. Kadın menstrüel siklusundaki ortalama serum konsnatrasyonu erken folliküler fazda 150.6 +/- 26.1 pg/mL’den orta luteal fazda 692.2 +/- 113 pg/mL’ye yükseldi. Bu assay insan reprodüksiyonunda inhibinle ilişkili proteinlerin rolünü araştırmak için kullanışlı bir araç sunmaktadır. İnhibin formlarına yönelik diğer assay’lerin hassasiyetlerinin yetersiz kaldığı durumlarda belirgin klinik değere sahip olabilir.

 

12

Groome, N.P. and O’Brien, M., Pai. R., Mather, Rodger, F.E., Mather, J. And McNeilly, A. (1996) Measurement of circulating dimeric inhibin-B in the human menstrual cycle using a new ultrasensitive ELISA. J. Clin.endocrinol. Metab. 81, 1401-1405.

(Yeni bir ultrasensitif ELISA kullanılarak insan menstrüel siklusundaki dolaşımdaki dimerik inhibin B’nin ölçülmesi 1996 – J. Clin. Endocrinol. Metab.)

Bu yayın inhibin B için spesifik ve sensitif bir assayin gelişimini ve bunun insan menstrüel siklusu esnasında plazmadaki inhibin B konsantrasyonlarının ölçümüne uygulanmasını tanımlamaktadır. Beta B-subunitten sentetik bir peptide karşı yükselmiş olan monoklonal bir antikor, çifte antikor ELISA formatındaki bir inhibin alfa-subunit sekansına karşı gelişen antikor ile kombine edildi. Geçerliliği sağlanmış olan bu assay’in 10 pg/mL’lik bir saptama limitine ve inhibin A ile %0.5’lik çapraz reaksiyona sahipti. Bu immunoassayi kullanarak, siklus arası FSH yükselişinden somraki günde erken folliküler fazdaki inhibin B plazma konsantrasyonunun hızla yükselerek 85.2+/-9.6pg/mL’li,k bir zirveye çıktığını, sonra folliküler fazın geri kalanında progresif olarak düştüğünü bulduk. Siklus ortası LH zirvesinden sonraki 2 gün, inhibin B konsantrasyonunda kısa süreli bir zirve (133.6+/-31.2 pg/mL) vardı, bu daha sonra luteal fazın geri kalanında düşük bir konsantrasyona (<20pg/mL) indi bunun aksine erken foliküler fazda  inhibin A konsantrasyonu düşüktü, ovulkasyonda yükseldi ve luteal faz esnasında maksimuma çıktı. Foliküler sıvı örneklerindeki inhibin B konsantrasyonu inhibin A’ya göre 20-200 kat daha yüksekti ve erken foliküler fazda alınan foliküler sıvı örneklerinde en yüksek düzeydeydi. İnhibin B preovulatuvar folikülde inhibinin önde gelen formu olarak görünmektedir. İnsan menstrüel siklusu esnasında gözlenen dolaşımdaki inhibeib B ve A konsantrasyonlarının farklı paternleri, bu formların farklı fizyolojik rollere sahip olabileceğini düşündürmektedir.

 

13

 

İnhibin ve inhibinin subunitleri folliküler sıvı ve muhtemelen kanda çok sayıda moleküler form şeklinde ortaya çıkmaktadır. Bu formlardan bazılarına yönelik spesifik immünoassaylerin gelişimi, ve uygulaması önemli bir problemdir. Öncelikle, assaylerin gereken sensitivite ve spesifitede olması için iyi tanımlanmış epitoplara karşı reaktif olan yüksek afiniteli antikorlar gerekmektedir. İkinci olarak, inhibin immünoassaylarinin sonuçları yorumlanacak ve kabul edilecekse, önce herbir assay ile hangi inhibin formlarının ölçülebilir olduğunun belirlenmesi ve bununla inhibin ile ilişkili mevcut materyalin toplamının karşılaştırılması gerekir.

Laboratuvarımız, 20KD’lik insan inhibin alfa subunitinin 1-32 sekansına ve beta-A subunitinin 82-114 sekansına karşı fare monoklonal antikorlarının hazırlanmasını ve rekombinan inhibin ve aktivin için yapılan iki-yönlü immünoassay’lerde bu antikorların kullanımımını daha önceden tanımlamıştı. Şimdiki yayında, 43 KD alfa subunitinin 1-15 sekansı ile reaksiyon gösteren yeni bir rat monoklonal antikorunun hazırlanmasını tarif ediyor ve, bir amplifiye alkalen fosfataz saptama sistemi ile, antikorlarımızın inhibin ve inhibinin subunitlerinin çeşitli moleküler formları için kullanılacak sensi,tif iki yönlü assayleri oluşturmak için kullanılabileceğini göstermekteyiz. Erken veriler bu assay’lerin insan serum örnekleri için uygun olabileceğini düşündürmektedir.

İnhibinin bu antikorlarının immünositokimya, immunoblotting ve imunoafinite kromatografisi için de yararlı olacağı gösterilmiştir. Peptid immünojenlere karşı yükselen antikorların inhibin çalışmasında giderek artan bir yararda olması olasıdır.

 

14

 

Illingworth, P., Groome, N.P., Duncan, R., Grant, V., Tovanabutra, S., Baird, D.T. and McNeilly, A. (1996) Circulating forms of inhibin in human pregnancy.J. Clin.Endocrinol. Metab. 81,1471-1475.

(İnsan gebeliğinde dolaşımdaki inhibin formları 1996 – J. Clin. Endocrinol. Metab.)

Bu çalışmada 1) çok erken gebelikte, 2) egzojen hCG tarafından korpus luteumun stimülasyonundan sonra ve 3) anormal ve sürmeyen insan gebeliklerinde dolaşıma salınan inhibin formlarını araştırıldı. Örnekler inhibin A, inhibin B ve inihibin pro alfa-C ilişkili immünoreaktivite (pro-alfaC-RI) için ELISA ile test edildi. İnhibin A konsantrasyonu konsepsiyon luteal fazı esnasında sabit şekilde yükselerek ovulasyondan 12 gün sonra ilk zirvesine (104+/-23 pg/ml) ulaştı, sonra daha hızlı şekilde yükselerek ovulasyondan 43 gün sonra 2 bir zirveye (424+/- 6 pg/ml) ulaştı. Pro-alfaCRI konsantrasyonu ovulasyondan sonraki 15.günde çok daha büyük bir pik gösterdi (1423+/-361pg/ml) ancak daha sonra düştü. İnhibin B konsantrasyonu ovulasyondan sonra düşüktü ve sonrasında gebelikle ancak saptanabilir düzeylerdeydi. hCG tedavisi inhibin A ve proalfaC-RI konsantrasyonlarında ciddi bir yükselişle sonlandı ancak inhibin B konsantrasyonuna etkisi olmadı. ProalfaC-RI konsantrasyonu hem hCG hem de inhibin A’ya göre gebeliğin devamının daha iyi bir endikatörüydü. Erken trofoblastlar korpus luteuma göre orantısal olarak daha fazla biyoaktiff inhibin salgılarlar, korpus luteum ve trofoblastlar dolaşıma inhibin B salgılamazlar. Bu veriler farklı inhibinlerin farklı fizyolojik rolleri olduğu kavramını desteklemektedir.

 

15

 

Illıngworth, P., Groome,N.P., Byrd, W., Rainey, W.E., McNeilly, A., Mather, J.P. and Bremner, W Inhibin-B: a likely candidate for the physiologically important form of inhibin in men. (1996) J.Clin. Endocrinol. Metab. 81, 1321-1325.

(Erkeklerde fizyolojik olarak önemli inhibin formu için olası bir aday 1996 – J. Clin. Endocrinol. Metab.)

İnhibin hipofiz FSH üretiminin inhibisyonunun temelinde tanımlanan bir glikoportein hormondur. Bununla birlikte, önceki veriler erkeklerde inhibin ve FSH’nın RIA ölçümleri rasında herhangibir korelasyon göstermemiştir. İnhibin A, inhibin B ve inhibin proalfaC-ilişki immünoreaktivite için spesifik olan yeni ELISA’lar 32 sağlıklı erkekte inhibin ölçümü için uygulandı. İnhibin B ve proalfaC-RI için, semen donörleri, infertil erkekler ve yüksek FSH konsantarsyonları olan erkeklerin bulunduğu geniş bir aralıkta FSH konsantrasyonlarına sahip erkek gruplarında ekstra ölçümler yapıldı. İnhibin A çalışılan bütün erkeklerde saptanabilir değildi (<2pg/ml). Çalışılan bütün erkeklerin ölçülebilir düzeyde inhibin B (135 pg/mL güvenlik aralığı 108.4-169.4) ve proalfaC-RI (426.3 pg/mL güvenlik aralığı 378.4-480.2) konsantrasyonları vardı. Semen donörlerinde, infertil erkeklerde ve yüksek FSH konsantrasyonu olan erkeklerde inhibin B ile FSH konsantrasyonları arasında yakın bir negatif korelasyon bulundu (sırasıyla, r=-0.69; p<0.001; r=-0.81; p<0.001; r=-0.54; p<0.01), ancak sağlıklı gönüllü grubunda durum böyle değildi (r=-0.08; p=NS). Çalışılan bütün gruplarda proalfaC-RI ile FSH konsantrasyonları arasında korelasyon gözlenmedi. Bu sonuçlar erkeklerde fizyolojik olarak önemli olan inhibin formunun FSH salınımında kritik etkisi olan inhibin B olduğunu güçlü şekilde desteklemektedir. İnhibin B testiküler fonksiyonun klinik olarak yararlı bir serum markeri olabilir.

 

16

Klein, N., Illingworth, P., Groome, N.p., McNeilly, A., Battaglia, D.E. and Soules, M. (1996) Decreased inhibin-B secretion is associated with the monotropic FSH rise in older ovulatory women: A study of serum and follicular fluid inhibin-A and B levels in spontaneous cycles. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81, 2742-2745.

(Azalmış inhibin B sekresyonu yaşlı ovulatuvar kadınlarda monotropik FSH yükselişine eşlik etmektedir: spontan menstrüel sikluslarda serum ve folliküler sıvı inhibin A ve inhibin B düzeylerinin bir çalışması 1996 – J. Clin. Endocrinol. Metab.)

Bu çalışmada normal yaşlı ve genç ovulatuvar kadınlarda dimerik inhibin A ve B için spesifik iki-yönlü ELISA kullanarak bu hormonların dolaşımdaki ve folliküler sıvıdaki (FF) konsantrasyonlarını karşılaştırılmıştır.

Metod: 40-45 (n=10), 20-25 (n=13) yaşlarındaki normal ovulasyonlu kadınlar folliküler faz boyunca günlük kan örnekleme, trans vajinal ultrason incelemesi ve dominant folikül aspirasyonu ile incelendi. Dominant follikül ortalamam 16mm’lik çapa ulaştığında veya serum östrodiolü (E (2)) 550pmol/L’ye eşit yada ondan büyük olduğunda, transvajinal follikül aspirasyonundan 32 saat sonra 10000IU hCG intramüsküler olarak uygulandı. Serum ve FF örnekleri E(2), FSH ve inhibin A ile B için analiz edildi. Günlük hormon düzeyleri ANOVA ile kıyaslandı, ortalama sonuçlar t-testleri kullanarak kıyaslandı

Sonuçlar: Yaşlı kadınlarda dominant folikül daha erken oluşarak hCG siklus günü için kriterleri karşıladı (10.6+/-0.4’e karşılık 14.5+/-1.0, p<0.001). Beklendiği şekilde yaşlı grupta genç gruba kıyasla daha yüksek maksimal serum FSH konsantasyonları vardı (11.4+/-0.5’e karşılık 8.0+/-0.4IU/L, p<0.001). 1-3. günlerde ki hormon konsantrasyonlarını karşılaştırdık (0. gün maksimal FSH konsantasyon günü). E(2) konsantasryonu yaşlı kadınlarda daha yüksekti (p=0.02) ve inhibin A sekresyonunda önemli fark yoktu (p=0.61). bunun tersine ortalama inhibin B konsantrasyonu yaşlı kadınlarda anlamlı derecede düşüktü (p=0.04). dominant folikülün aspirasyon gününde serum inhibin B yaşlı deneklerde azalırken (42.6+/-6.5’a karşılık 153.1+/-53pg/ml, p=0.02), yaşlı deneklerde daha yüksek düzeylerde inhibin A (10.6+/-16’a karşılık 60.4+/-9.4pg/ml, p=0.04) ve benzer E(2) düzeyleri (665+/-35.2’a karşılık 687+/-92pg/ml, p=0.83) vardı. Yaşlı ve genç kadınlarda inhibin B (164+/-31’a karşılık 174+/-37ng/ml, p=0.83), inhibin A (317.7+/-38’a karşılık 248+/-57ng/ml, p=0.16)ve E(2) (2074+/-294’a karşılık 2474+/-338nmol/L, p=0.82)’nın FF konsantrasyonları arasında fark yoktu.

Özet: Monotropik FSH yükleslişi gösteren yaşlı ovulatuvar kadınlarda, foliküler faz inhibin B sekresyonu düşerken, inhibin A sekresyonu yaşlı kadınlarınkine benzerdi. Bu yaşlı kadınlardaki dominant folikül, FF E(2) ce inhinbin B içeriği bakımından normal görünmekteydi. Yaşlı kadınlarda Azalmış inhibin B sekresyonunun foliküler havuzda bir düşüşü yüksek olasılıkla yansıttığını ve monotropik FSH yükselişinin önemli bir regülatör olabileceğini bulduk.

 

17

 

Knight, P.G., Muttukrishna, S. and Groome, N.P. (1996) Development and application of a two-site enzyme immunoassay for the determination of total activin-A in serum and follicular fluid.J. Endocrinology. 148,267-279.

(Serum ve folliküler sıvıda total aktivin A’nın saptanması için iki-yönlü bir enzim immünoassay’in geliştirilmesi ve uygulanması 1996 – J. Endocrinology)

Aktivin için kullanılan mevcut immunoassay ve biyoassay’lerin uygulanması biyolojik sıvılarda follistatin ve alfa(2) makroglobulin (alfa(2)M) gibi aktivin-bağlayıcı proteinlerin varlığı nedeniyle sorunlu olmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için, bir analit denatürasyon ve oksidasyon basamağı içinde olan aktivin h için yeni bir iki-yönlü enzim immunoassay prosedürü geliştirdik. Optimize assay sensitif (saptanma sınırı yaklaşık 10pg/kuyu), kesin (sırasıyla, %4.9 ve 9.1’lik plak içi ve plaklar arası ortalama) ve doğrudur (sırasıyla, sığır foliküler sıvısı (FF) ve insan serumu için aktivin A düzelme değerleri %102 +/-3 ve 96 +/-5). Spesifite testlerinde, yüksek konsantrasyonlardaki follistatin (500 ng/ml) ve alfa(2)M (100 mu g/ml) aktivin A’nın yanıt sinyalini bozmadı. Ek olarak, inhibin-A, inhibin-B, aktivin-B (hepsi <%0.5), sığır pro- alfa C ve follistatin (her ikisi <%0.1) olmak üzere bir dizi ilişkili molekülle ciddi çapraz reaktivite görülmemiştir. Sığır, insan, koyun ve domuz FF, insan serumu ve kültüre sığır ve insan granüloza hücre besiyerlerinde alınan bir dizi test örneğinde aktvin A standart eğrisine paralel eğriler elde edilmiştir. SDS-PAGE ile sığır FF’sinin fraksiyonizasyonu assay spesifitesini teyit etmiştir çünkü elusyonlu jel dilimlerinde yalnızca bir aktivin A immunoreaktivite piki saptanmıştır (25 k’ya benzer M(r)). Bununla birlikte, jel-permeasyon kromatografisi, fizyolojik koşullar altında sığır FF’sinde saptanabilen bütün aktivin A’nın, >700 ve 60-200’lük belirgin M(r) değerleriyle gözden kaçtığını bunun da bağlayıcı proteinlerle ilişkisini yansıttığını göstermiştir. Luteal faz esnasında morfolojik olarak dominant folikülden alınan inek FF serum örneklerinin (n=76) analizi, aktivin A düzeylerinin inhibin-A ile pozitif korelasyon gösterdiğini (r=+0.54; p<0.001)ve total beta subunit immünreaktivitesinin (r=+0.32;p<0.005)  (fakat total alfa subunit immüreaktivitesi değil (r=-0.09)) varlığını göstermiştir. Östrojenik dudruma göre bu folliküllerin klasifikasyonu aktivin-A, inhibin-A ve total beta subunit düzeylerinin östrojen-inaktif foliküllerde en yüksekken (P<0.01), total alfa subunit düzeylerinin bu foliküllerde en düşük (P<0.001) olduğunu göstermiştir.

Tüm insan serum örnekleri analize edildiğinde, Aktivin-a düzeyleri, normal menstrüel siklus esnasında 128 pg/ml’den, ovarian hiperstimülasyon tedavisi alan kadında 210 pg/ml’den, ve postmenopozal kadında yaklaşık 500 pg/ml’den gebelik sırasında 4000 pg/ml üzerine değişim göstermiştir. Özetle, mevcut assay, çeşitli biyolojik örneklerde, total aktivin-A konsantrasyonlarını ölçmede güvenilir bir metod sağlamaktadır ve insanları kapsayan çeşitli türlerin daha ileri invivo ve invitro çalışmalarında kullanışlı olacaktır.

 

18

Lambert, G.M., Hall, J.E., Sluss, P.M., Taylor, A.E., Martin, K.A., Groome, N.P., Crowley, W.E and Schneyer, A.l. (1994) Relatively low levels of dimeric inhibin circulate in men and women with polycystic ovarian syndrome using a specific two-site ELISA J. Clin. Endocrinol. Metab. 79, 45-50.

(Spesifik bir iki yönlü ELISA kullanarak polikistik over sendromu olan erkek ve kadınlarda dolaşımda bulunan rölatif olarak düşük düzeylerdeki dimerik inhibin 1994 – J. Clin. Endocrinol. Metab.)

 

Dimerik inhibinin hipofizden salınan FSH sekresyonu üzerine endokrin feedback rolü pek çok türde iyi anlaşılmıştır, bununla beraber, çok narin olan insanlardaki FSH’nın önemli bir endokrin regülatör olduğu kanıtlanmıştır.  Bu iki anlama gelen veriler için bir potansiyel açıklaması insanda çok yaygın olarak kullanılan inhibin immünassay’inin bir antiserum (hem morfometrik formlarında hem de inhibin dimerlerinde yalnızca inhibin alfa subunitini tanıyan)  ile heterolog bir assay olması olabilir. Bu çalışmanın amacı fertil ve infertil erkek ve kadınlarda yeni ultrasensitif enzim-bağımlı immunsorban assay (sadece dimerik form (alfa/beta) için spesifik olan) kullanılarak serum inhibin düzeylerini ölçmektir. Şimdiki assay’in spesifitesi Muller inhibisyon maddesi, transforming growth faktör-beta, aktivin, FSH, LH, hCG, TSH ve hCG alfa ile inhibinin alfa subunitiyle ciddi çapraz reaktivite olmamasıyla gösterildi. Bu assay 1 pg/ml hassasiyetindeydi ve erkek ve dişi insan serum örneklerinin seri dilüsyonları rekombinan 32-kilodalton (kDa) dimerik inhibin standart eğrisine paraleldi. Seruma eklenen 32 kDa’lık ekzojen rekombinan inhibinden tam temizlenme elde edildi. Ortalama serum inhibin düzeyleri erken folliküler fazda 5.7 +/- 0.6 pg/mL’den normal menstrüel siklusun midluteal fazında 49.0c 11.2 pg/mL’ye kadar değişiklik gösterdi ve ovulasyon indüksiyonu ve gebelik esnasında yükseldi (sırasıyla, 1250 pg/mL ve 500 pg/mL). Şaşırtıcı şekilde, polikistik over sendromlu (PCOS) kadınlarda dimerik inhibinin ortalama düzeyleri normal folliküler fazdan ayrılabilir düzeyde değildi. En dikkat çekici gözlem ise normal erkeklerde, herhangi bir pulsatil GnRH tedavisinden önceki GnRH eksikliği olan erkeklerde ve Klinefelter sendromu olan erkeklerde aşırı dercede düşük inhibin düzeylerinin (<2 pg/mL) olmasıydı, bunlardan hiçbirisi postmenapozal kadınlarda gözlenen düzeylerden düşük değildi. Erkeklerdeki bu gözlemlerin nedeni muhtemelen şunlara bağlıydı, 1) ya yapılarına ya da 32 kDa’lık rekombinan inhibini bağlamayan ancak endojen inhibini bağlayan özel bir bağlayıcı proteinin varlığına bağlı olarak insanda bazı dolaşımda bulunan ve biyoaktif inhibin formlarının bu assay ile saptanamıştır; veya 2) dimerik inhibin erkek insanda FSH’nın major bir endokrin regülatorü değildir. Ek olarak, gebelik esnasındaki ve gonadotropin stimülasyonu sonrasında normal mesntrüel siklusun ortasındaki ve luteal fazındaki göreceli olarak yüksek dimerik inhibin düzeyleri, dimerik inhibinin temel olarak dominant folliküller, korpus luteumlar ve plasental dokularca üretildiğini düşündürmektedir.

 

19

 

Lockwood G.M., Muttukrishna S., Groome N.P., Knight P.G., Ledger L. (1996) Circulating inhibins and activin A during GnRH-analogue down-regulation and ovarian hyperstimulation with recombinant FSH for in-vitro fertilization-embryo transfer. Clinical Endocrinology 45,741-748.

(İnvitro fertilizasyon-embriyo transferi için rekombinan FSH ile GnRH-analog down regülasyonu ve over hiperstimülasyonu esnasında dolaşımdaki inhibinler ve aktivin A - 1996 –Clinical Endocrinology)

AMAÇ: IVF tedavisinin ‘uzun-protokol’ aşağı regüle sikluslarında rekombina FSHile stimilasyon yapılan kadınlarda inhibin A, inhibin B, pro alfa-C ve aktivin A’nın plazma konsantrasyonlarındaki seri değişiklikleri araştırdık.

DÜZEN: Tedavi öncesi siklusun erken folliküler fazı, hipofiz aşağı regülasyonu, rekombinan FSH ile stimülasyon, ovulaytuvar tetikleme ve siklusun luteal fazı ile örtüşen noktalarda IVF tedavi siklusunun tamamı esnasında kan örnekleri toplandı. Konsepsiyponun geliştiği hastalarda gebeliğin ilk 2 haftası esnasında da kan örnekleri alındı. Bütün örnekler inhibin A, inhibin B, pro alfa-C, aktivin A ve östrodiaol için analiz edildi.

HASTALAR: Tubal faktör, hafif endometriozis veya idiopatik inferti,lite hnedeniyle IVF tedavisi yapılan normal over fonksiyonlu 15 kadın.

SONUÇLAR: Hipofiz desensitizasyonu esnasında, hem inhibin A hem de inhibin B’e önemli miktarda azalırken (sırasıyla, P<0.001, p=0.002), proalfa-C ve aktivin A düzeyleri genel olarak değişmedi. FSH stimülasyonu esnasında her iki inhibinde belirgin şekilde arttı (p<0.01) ve ovulatuvar tetiklemenin sonrasındaki gün inhibin A’da ekstra bir yükseliş saptandı. Oosit toplanması esnası ve sonrasında hem inhibin A hem de inhibin B düğzeylerinde düşme oldu ve luteal faz esnasında bu düşe devam etti. Gonadotropin stimülasyonu esnasında aktivin A düzeyleri daha az belirgin olacak şekilde yükseldi. İstatistiksel analiz geç folliküler faz esnasında folliküllerin (>10mm)sayısı  ile serum inhibin A (r=0.65; P<0.01) ve proalfa-C (r=0.65; P<0.01) konsantrasyonları arasında yüksek derecede konsantrasyon gösterdi. 

ÖZET: Bu sonuçlar overde dimerik inhibin A ve B üretiminin gonadotropine bağlıolduğuna, buna karşın aktivin A’nın önemli derecede gonadotropin bağımsız veya ekstragonadal bir kaynağa sahip olduğuna işaret etmektedir. İnhibin A ve proalfa-C gonadotropin stimülasyonunun etkilerini izlemek için yararlı markerler olabilir.

 

20

 

McConnell, D.S., Padmanabhan, V., Pollak, T.B., Groome, N.P., Ireland, J. and Midgely, R. (1996)

Development of a two-site solid phase immunohemiluminescent assay for measurement of dimeric inhibin in human serum and other biological fluids. Clinical Chemistry 42, 1159-1167.

(İnsan serumu ve diğer biyolojik sıvılarında dimerik inhibinin ölçümü için iki-yönlü bir solid faz immunokemilüminesan assay’in geliştirilmesi -1996 – Clinical Chemistry)

İnhibin hipofizden follitropin sekresyonunu inhibe eden heterodimerik bir glikoproteindir ve ortak bir subunit ile ya beta(A) veya beta(B) subunitinden oluşan iki farklı form şeklinde izole edilmiştir. Alfa ve beta (A) subunitine spesifik eşli monoklonal antikorları kullanarak dimerik inhibin A için bir immünokemilüminesan assay geliştirdik. Bu assay insan serumunda ve folliküler sıvısında serbest ve bağlı inhibin-h’nin ölçülmesini sağlayabilmektedir. Saptama limiti 10ng/L’dir. İlişkili proteinler küçük miktarda çapraz reaktivite veya etkileşim göstermektedir, düzelme mükemmeldir. Erkeklerden ve pğost menopozal kadınlardan alınan örnekler bu assay’in saptama limitine yakın iken, inhibin A siklısları normal kadınların luteal fazında folliküler faza göre daha yüksek, invitro fertilizasyon tedavisi esnasında 20 kat yüksek ve gebelikte 200 kat yüksektir. Bu assay çok sayıda diğer hayvan türlerinin folliküler sıvısındaki inhibin A’ı ölçmektedir.

 

21

Muttukrishna, S., Fowler, P.A., Groome, N.P., Mitchell,G.G., Robertson, W.R and Knight, P.G. (1994) Serum concentrations of dimeric inhibin during the spontaneous human menstrual cycle and after treatment with exogenous gonadotrophins Human Reproduction 9, 1634-1642.

(Spontan insan menstrüel siklusu esnasında ve egzojen gonadotropinlerle tedaviden sonra dimerik inhibinin serum konsantrasyonu 1994 – Human Reproduction)

Yakınlarda bir pre-assay oksidasyon basamağını bütünleştiren açıklanmış iki-yönlü enzim immunoassay geçerli idi ve normal siklusu olan 5 kadında ve gonadotropin tedavisi alan 13 kadında dimerik inhibinin serum konsantrasyonlarını ölçmede kullanıldı. Rekombinan insan inhibin A’sı (standart) insan serum örneklerininkine paralel bir assay yanıt eğrisi verdi ve assayden önce serum örneklerine eklenen egzojen inhibinin geri alınması ölçülür düzeydeydi (%109+/-8, n=11) normal menstrüel siklus esnasında dşmerik inhibin konsantrasyonu, erken foliküler fazdaki 9.0+/-2.0 pg/ml düzeyinden siklus ortasındaki 55.3+/-11.1 pg/ml’lik zirvesine ulaştı (preovulatuvar gonadotropin zirvesi ile çakışacak şekilde). LH zirvesinden 1 gün sonraki 27.9+/-5.7 pg/ml’lik düzeye düştükten sonra, inhibin orta luteal faz esnasında 115.6+/-19.3 pg/ml’lik bir zirve değere ulaşmak üzere serum progesteron ile paralel olarak yükseldi, daha sonra sonraki mensin başlangıcına kadar 14.1+/-4.9 pg/ml’e indi. Folliküler faz esnasında dimerik inhibin konsantrasyonları serum östrodiolünki ile yakın korelasyon gösterirken (r=0.69; p<0.001), luteal faz esnasında serum progesteron konsantrasyonları ile çok yakın korelasyon gösterdi (r=0.73; p<0.001). İnsan menopozal gonadotropin ile günlük tedavi (6 gün içinde 20 kat artan) serum dimerik inhibin konsantrasyonunda progresif bir artuışa neden oldu. Aynı dönemde, total ac inhibin (RIA ile ölçülen) 5 kat artarken, serum östrodiolü 30 kat arttı. 200-30 KD aralığındaki moleküler kitlelelin dimerik inhibin formları ile bu assay çapraz reaksiyon gösterse de süper ovulatuvar insan serum kromatografisi 30KD’luk tam işlenmiş formun dolaşımdaki temel form olduğunu ancak bunun oranının (yaklaşık %30) reversible olarak serum bağlayıcı proteinleri ile birliktedir.

 

22

 

Muttukrishna, S., George, L., Fowler, P.A., Groome, N.P., Knight, P. (1994) Measurement of serum dimeric inhibin-A concentrations in human pregnancy. Clin. Endocrinol. 42, 391-397.

(İnsan gebeliğinse serum dimerik inhibin A konsantrasyonlarının ölçümü - 1994 –Clin. Endocrinol.)

AMAÇ: Gebe serumunda hangi moleküler ağırlıktaki formun veya formların mevcut olduğunu belirlemek ve inhibin A konsantrasyonları ile östrodiol ve progesteronunkileri ilişkilendirmek üzere normal insan gebeliği esnasında periferik serumda inhibin A(alfa-beta(A) dimeri) konsantrasyonlarını ölçmek.

DÜZEN: Retrospektif bir çapraz kesitsel çalışmada gestasyonun 8-33. haftalarında 2 haftalık aralıklarla da toplanan 211 serum örneği enzim immünassay ile inhibin A için ve RIA ile östrodiol ve progesteron için analiz edildi. 1., 2., 3. trimesterlere karşılık gelen toplanmış örnekler mevcut inhibin formlarının kromatografik analizi için daha sonradan hızlı protein likit kromatografide kullanıldı.

HASTALAR: Antenatal kliniğine devam eden normal gebe kadınlardan örnekler alındı.

SONUÇLAR: Periferik serumdaki inhibin A konsnatrasyonları gebeliğin 8. haftasındaki 1.76+/-0.15 MU g/l düzeyinden gebeliğin 16. haftasındaki 0.86+/-0.12 MU g/l düzeyine kademeli olarak indi (P<0.01). 2. trimester esnasında konsantrasyonlar düşük olarak kaldı. Ancak 3. trimester esnasında belirgin olarak (P<0.01) yükselerek 36. haftadaki 5.68+/-0.89 MU g/l’lik maksimum düzeye ulaştı. 1., 2. ve 3. trimesterde alınan toplanmış serum örneklerinin kromatografik serum analisi tam işlenmiş 31KFD’luk molekülün insan gebeliği boyunca dolaşımdaki inhibin A’nın önde gelen şekli olduğunu gösterdi. Benzer şekilde, yalknızca 31KD’lik form termdeki plasenta ekstresinde saptandı (20 MU g inhibin-A/kgdoku)içermekteydi.

ÖZET: inhibin A (31KD’lik form) insan gebeliği boyunca spontan menstrüel siklus esnasında bulunan maksimum değerlerden (yaklaşık 100ng/L) 50 kat daha yüksek konsantrasyonlarda periferik kanda bulunmaktadır. 3. trimester esnasında en yüksek serum değerleri ve termdeki plasentadaki yüksek konsantrasyonlarla ilgili bulgu bu materyalin lutealden ziyade plasental bir kökeni olduğunu sıkı şekilde desteklemektedir.

 

24

 

Muttukrishna, S., Fowler, P.A., George, l., Groome, N.P. and Knight, P.G. (1996) Changes in peripheral serum levels of “total” activin-A during the human menstrual cycle and pergnancy. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81, 3328-3334.

 

25

 

Muttukrishna, S., Child, T.J., Groome, N.P. and Ledger, W.L. (1996) Feto-placental unit is the major source of inhibin-A and activin-A early pregnancy. J. Endocrinol. 81:3328-3334

(Fetoplasental unite erken gebelikte inhibin A ve aktivin A’nın majör kaynağıdır 1995 – J. Endocrinol.)

AMAÇ: Artık inhibin glikoprotein hormonunun primat granüloza hücreleri ve insan korpus luteumu ve plasenta trofoblsatı tarafından üretildiği bilinmektedir. Bu çalışma yüksek spesifite ve sensitivitedeki yeni bir panel assay’leri kullanarak erken gebelikteki inhibinlerin ve aktivin A’nın majör kaynağını araştırmak üzere düzenlendi.

MATERYAL-METOT: Gebeliğin ilk trimesterinde (6-12. gebelik haftaları) gebeliğin sonlandırılması (TOP) sözkonusu olan ilk gebeliği olan 8 kadın (20-35 yaşlarında) çalışma için toplandı. TOP’den önce, TOP’den sonraki 1 saat her 15 dakikada bir ve sonra 5 ssat boyunca saatlik kan örnekleri alındı.

SONUÇLAR: Dolaşımdaki, inhibin A, proalfa-C, aktivin a, hCG, östrodiol ve progesteron konsantrtrasyonları menstrüel siklusun bütün aşamalrındakine göre erken gebelikte daha yüksekti. İnhibin A ve aktivin A’nın periferik konsantrasyonları ilk saat içinde belirgin olarak azaldı ve çalışma periyodu içinde kademeli olarak daha düşük konsantrasyoa indi. İnhbin B konsantrasyonu menstrüel siklusa kıyasla erken gebelikte yükselmedi ve TOOP’den sonra değişmedi. Pro-alfa C konsantrasyonu ilk saat içinde azaldı ve sonraki 4 saatte değişmeden kaldı. benzer şekilde TOP’den sonraki 5 saatte hCG, östrodiol ve progesteronun dolaşımdaki konsantrasyonu önemli derecede azaldı. Korelasyon analizleri çalışma periyodu boyunca inhibin A, akti,vin A, hCG, progesteron ve östrodsiol konsantrasyonları arasında önemli derecede bir posizitf korelasyon (P<0.001) göstermektedir.

ÖZET: Fetoplasental ünite erken gebelikte inhibin A ve aktivin A’nın majör kaynağıdır. İnhibin B ilk trimestere kadar insan plasentası tarafından üretilmemektedir. İnhibin A ve aktivin A’nın erken gebelikte ölçümü anormal gebeliklerin belirteçleri olarak kullanılabilir.

 

27

 

Price, C., Carriere, P.D., Bhatia, b. and Groome, N.P. (1995) Comparison of hormonal and histological changes during follicular growth as measured by ultrasonography in cattle. J.Reprod.Fertil. 103,63-68.

(Sığırlarda ultrasonografi ile ölçülen foliküler gelişim esnasında hormonal ve histolojik değişikliklerin kıyaslanması - 1995 – J. Reprod. Fertil.)

Bu çalışmanın amacı ineklerde follükül gelişimi ile gerilemsini in vivo ultrason ile izleyerek over follikül sağlığının histolojik ve endokrinolojik endekslerini kıyaslamaktı. Ultrason taraması günlük olarak gerçekletirilde. Folliküller ooferektomi ile elde edildi; folliküler sıvılar assay için toplandı ve atrezi derecesi histolojik olarak değerlendirildi.  Anovulatuar gelişen ve gerileyen folliküller kıyaslandığında histolojik atrezi gelişim paternleri ile korelason gösteriyordu (P<0.05), ancak gelişen ve statik folliküller arasında farklı değildi. Östradiol konsantrasyonları gelişen folliküllere göre statik olanlarda daha düşüktü, ancak bu fark anlamlı değildi (35+/-7’ye karşın 260+/-120 ml/l; P<0.08) ve gerileyen folliküllerde anlamlı derecede düşüktü (7+/-5 ng/ml; P<0.05). Östradiol konsantrasyonları histolojik olarak atrezili olanlarda olmayanlara kıyasla anlamlı derecede daha düşüktü (16+/-8’ye karşın 282+/-132 ml/l; P<0.05), ancak atrezili olmayan ve erken atrezideki folliküller arasında farklı değildi (P>0.05). östradiol konsantrasyonu ile follikülün ultrasonla görülebildiği gün sayısında anlamlı derecede negatif bir korelasyon vardı (r=-0.71; P<0.001). folliküler sıvıdaki progesteron konsantrasyonu ile folliküllerin saptandığı günlerin sayısı arasında korelasyon vardı (r=-0.61; P<0.01) ve gelişen follkülerdekine göre gerileyenlerde daha yüksekti (122+/-71’e karşın 48+/-13 ng/ml; p<0.05) ancak atrezili olmayan folliküllere kıyasla atrezili folliküllerde anlamlı derecede yüksek değildi (129+/-102’e karşın 53+/-15 ng/ml(-1)). Progesteron:östrodiol oranı folikülün ultrason ile saptanabildiği gün sayısı ile anlamlı derecede korelasyon göstyerdi (r=0.8; p<0.001) ve regrese olanda büyüyen foliküle göre daha yüksekti  ve atretik folikülde, nonatretik folikülünlinden daha yüksekti (P<0.05). foliküler sıvıdaki dimerik inhibin konsantrasyonları folikülün ultrason ile saptanabildiği gün sayısı ile anlamlı derecede korelasyon göstermedi (p>0.05) fakat regrese olanda (3.0+/-0.7 mu g ml(-1)) büyüyen veya statik foliküle göre (1.2+/-0.2’e karşılık 1.1+/-0.2 mu g ml(-1)) anlamlı derecede (p<0.05)  yüksekti. İnhibin A konsantrasyonları atrezinin derecsinden belirign olarak etkilenmedi. Preovulatuvar folikülün östrodiol konsantrasyonları regrese folikülünkinden anlamlı derecede yüksekti (1131+/-382’e karşılık 35+/-7 mu g ml(-1); p<0.05) ve dimerik inhibinin konsantrasyonları daha düşüktü (1.0+/-0.2’e karşılık 3.9+/-0.4 mu g ml(-1); P<0.05). östrodiol ve inhibin konsantrasyonları negatif olarak korelasyon gösterdi (r=-0.65; p<0.05). dimerik inhibin konsantrasyonları gelişmekte olan nonovulatuvar ve tahmini preovulatuvar foliküller arasında benzer şekild idi (p>0.05). Bu sonuçlar, gelişmekte olan folliküllerin yüksek östradiol ve düşük progeseron ile inhibin konsantrasyonları içerdiğini, ve follikülün gelişme hızı azaldıkça, östradiol konsantrasyonlarının azaldığını ancak progesteron ve dimerik inhibin konsantrasyonlarının folliküller regrese olmaya başlayana kadar artmadığını göstermektedir. Atrezinin histolojik belirtileri follikül gelişiminin hem morfolojik hem de endokrinolojik ölçümleri yakından korelasyon göstermemektedir.

28

 

Price, C.A., Salah, N. and Groome, N.P. (1995) Plasma concentrations of dimeric inhibin and oestradiol in heifers undergoing superovulation with eCG or FSH. J. Reprod.Fertil. 103 Suppl. 49, 507-510.

(eCG veya FSH ile süper ovulasyona alınan düvelerde dimerik inhibin ve östrodiolün plazma konsantrasyonları - 1995 – J. Reprod. Fertil.)

Kadın memelilerde FSH’nın sekresyonunun ovarian östrodiol ve inhibin tarafından regüle edildiği genellikle kabul edilir. İneklerde, dolaşan östrodiol konsantrasyonunun paternleri iyi dökümante edilmesine rağmen, inhibinin ki bilinmemektedir. İnhibin için tanımlanan çoğu assay alfa subunite karşı gelişen antikorları kullanır ve sığır foliküler sıvısında serbest veya prekürsör alfa inhibin subunitinin birçok fırmu bulunduğundan (Knight , 1989), bu assayler bu türde geçerli değildir.

Yalnızca alfa-beta dimeri tranıyan (inhibinin biyolojik olarak aktif fıormu) iki-yönlü ELISA’nın gelişimi insan ve sığır foliküler sıvısı ile insan plazmasında inhbin dimerinin spesifik ölçümüne olanak vermiştir (Groome et al). bu makalede ilk defa sığır plazmasında kullanım için bu ELISA’nın adaptasyonunu ve süper ovulasyon için tedavi yapılan sığırlarda dimerik inhbinin saptanmasını bildiriyoruz.

29

Riley, S., Wathen, N.C., Chard, T., Groome, N.P. and Wallace, E.M. (1996) Inhibin in extra embryonic coelomic and amniotic fluids and maternal serum in early pregnancy. Human Reproduction 11, 2772-2776.

(Erken gebelikte ekstraembriyonik çölomik ve amniyotik sıvılarla maternal serumdaki inhibin - 1996 – Human Reproduction.)

İnhibinler gebelik esnasında anne serumunda mevcuttur. Bununla birlikte erken gebelikte fetüs etrafı kompartmanlarda inhibin varlığı iyi belirlenmemiştir. Yeni spesifik ELISA’lar kullananrak biyoaktif dimerik inhibin formları olan inhibin A ve inhibin Bile proalfa-C sekanslarını iç.eren immünoreaktif inhibin formlarını gebeliğin 8-11. haftaları arasında ekstra-embriyomik çölomik ve amniotik sıuvılarda ve anne serumunda farklı miktarlarda mevcut olduğunu gösterdik. Biyoaktif dimerik inhibinlerden hem inhibin A (ortalama +/-SEM 206.0+/-24.8 pg/ml) hem de inhibin B (62.0+/-8.6 pg/ml) ekstraembriyonik çölomda mevcuttur,  buna karşın amniyotik sıvıda dimerik inhibin bulunmaz ve anne sermunda yalnızca inhibin A bulunur (360.2+/-32.9 pg/ml) ek olarak, proalfa-C-ilişkili immünoreaktivite ekstaemriyonik çölomda (591.7+/-60.5 pg/ml), amniyotik sıvıda (452.4+/-76.5 pg/ml) ve maternal serumda (539.4+/-39.5 pg/ml) yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Bu bulgular, gebeliğin bu aşamasında inhibin A, inhibin B ve immünoreaktif proalfa-C içeren inhibin üretiminin muhtemelen fetüs, plasenta ve fetal membranlar ile over dahil maternal kaynakların bulunduğu çeşitli kaynaklardan köken aldığını göstermektedir. İnhibinler fetal ve plasental gelişimin önemli regülatörleri olabilir ve gebeliğin devamında rol alırlar.

 

30

Reinhart, P., Billiar, R., Hemmings, R., Smith, P and Groome, N.P (1995) Identification of biologically active inhibin in the peritoneal fluid of women. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 12, 55-60.

(Kadınların periton sıvısında biyolojik olarak aktif inhibinin belirlenmesi - 1995 – Journal of Assisted Reproduction and Genetics)

Amaç: İmmünoreaktif inhibinin (i-inhibin) kadınların peritoneal sıvısnda bulunduğu bildirilmiştir. Uygulanan RIA’lar serbest ve eşit derecede biyolojik olaak inaktif subunitleri, bunun yanında biyolojik aktif dimerik inhibini ölçmektedir. Şimdki çalışma biyolojik olarak olan dimerik inhibinin kadınların peritoneal sıvısında mevcut olup olmadığını belirlemek üzere düzenlenmiştir.

Metod: 4 kadının periton sıvısı RIA, koyun hipofiz biyoassay’ı ve  iki ELISA prosedürü (inhibinin alfa subunitini (ELISA-A) veya beta subunitini (ELISA-B) “yakalamak” için ve sonradan dimerik inhibin A’nın ölçülmesi için spesifik monoklonal antikorları kullanan prosedürler) ile ölçüldü.

Sonuçlar: RIA, biyoassay ve her iki ELISA ile elde edilen değerler arasında iyi bir korelasyon vardı; her dört assay’in hepsinde göreceli olarak yüksek i-inhibin konsantarsyonları olan iki örnek (geç foliküler fazdan) pozitifti. Buna karşın, çok düşük inhibin konsantrasyonları olan iki örnek (erken foliküler fazdan) iki örnek biyoassay ve ELISA’larda negatifti.                                                               Özet: Kadınların geç foliküler fazı esnasında elde edilen periton sıvısındaki immünreaktif inhibinin önemli bir kısmı biyolojik olarak aktif dimerik inhibindir. Bizler bunun oosit matürasyonu ve duktus içerisinde erken embriyogenezis üzerine olası etkilere sahip olabileceğini ileri sürmekteyiz.

 

31

İnsan plazmasında inhibin dimerinin (inhibin A) biyoaktif alfa-beta A subuniti spesifik olarak saptamak için son zamanlarda bir dizi immunoassay metodu geliştirilmiştir. Bununla birlikte, plazmada bulunan bir dizi inhibin formlarını saptama kabiliyetleri ve biyoaktivite ilişkileri bakımından bu assay’lerin spesifiteleri araştırılmaktadır. İnhibin insan folliküler sıvısında (hFF), gonadotropinle stimüle edilmiş kadınlardaki serum/plazmadan (IVF serumu) ve kombine bir immunoafinite/preparatif SDS-PAGE prosedürü kullanılarak postmenapozal kadınlarla erkek plazmasından fraksiyonize edilmiştir. İnhibinin moleküler ağırlık profili inhibin in vitro biyoassay, üç alfa-beta A subunit spesifik immunoassay ve üç alfa subunit-yönlendirilmiş immunoassay (inhibin A ve B formlarının yanında alfa subunitini de saptayan tetkik) ile belirlenmiştir. hFF inhibinde, 33, 36,55 ve 66 K formları invitrobiyoassay ve çoğu immunoassay (33K inhibin hariç; bir alfa-beta A ELISA’da saptanamadı) ile saptanmıştır. Alfa subunite yönlendirişlmiş assayler 29-31 K bölgesindeki aktiviteyi de saptadılar (bazı assaylerde oldukça yüksek düzeylerde). IVF serumunda bütün biyoaktif formları saptayamayan alfa-beta A assayleri ile 27*100K arasında invitro biyoaktivite ve immunoaktiviteler saptandı. Alfa subunite yönlendirilmiş assayler benzer immünoaktivite profilleri verdiler. Ne invitro biyoassay ne de alfa-beta A assayleri postmenopozal plazmada veya erkek plazmasında aktivite saptadı, buna karşın alfa subunitine yönlendirilmiş assayler 36 K’da belirgin olmak üzere pikler gösterdi (ancak düşük düzeylerde). Dimerik inhibin A’a özgü assaylerin hFF’de biyoaktif inhibin formlarını saptadığına ve IVF serumunda daha düşük bir meiktarda bunun belirlendiği sonucuna vardık. Bu örnekte yüksek alfa subunit düzeyleri yüzünden alfa subunitine yönşlendirilmişş assayler hFF’deki invitro biyoassy ile düşük derecede korelasyon gösterdi. IVF serumunda bu assayler arasında daha yüksek olan korelasyon az miktarda serbest alfa subunitinin bulunduğunu düşündürmüştür. Erkek plazmasındaki 36 K formu serbest alfa subuniti veya inhibin B olabilir.

 

32

 

Robertson, DM., Cahir, Findlay, J.K., n., Burger, H.G. and Groome, N.P. (1997) The Biologicaland immunological characterization of inhibin A and B in human follicular fluid and plasma j. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 889-896.

(İnsan folliküler sıvı ve plazmasında inhibn A ve B’nin biyolojik ve immünolojik karekterizasyonu - 1997 – J. Clin. Endocrinol. Metab.)

Önceki bir çalışmada (Robertson et al, 1996), kültürdeki koyun hipofiz hücrelerini kullanna invitro biyoassay ile spesifik inhibin A ile inhibin alfa subunitine yönlendirilmiş çeşitli immünoassayler ile fraksiyone insan foliküler sıvısında (hFF) ve insan erkek ve dişi plazma/serumunda inhibn aktivitesinin moleküler ağırlık dağılımı belirlenmişti. Bununla birlikte, koyun invitro biyoassayinin inhibin B’i zayıf şekilde saptadığı gösterildi. Fare hipofiz hücrelerini kullanan alternatif bir invitro biyoassayin (hem inhibin A hem de inhibin B’i saptayan, pro sekansını içeren inhibin formlarına yönlendirilmiş bir alfa subunit ELISA’sı (pro-alfa C) ve spesifik bir inhibin B ELISA’sı) dahil edilmesiyle bu bulgular şimdiki çalışmada genişletilmiştir. Kültürdeki fare hipofiz hücrelerini kullanan inhibin in vitro biyoaktivite profili, koyun hipofiz hücrelerini (r=0.85), inhibin A (r=0.70), inhibin B (r=0.89) ve inhibin A+B kombinasyonu (r=0.93) kullanan invitrobiyoaktivite ile anlamlı drecede korelasyon gösterdi (p<0.001), 65 K, 55 K, 36 K, ve 33K’da saptanan aktivite pikleri vardı, bunlar bilinen veya tahmin edilen inhibinin moleküler ağırlık formları ile uyumluydu. Gonadotropinlerle stimüle edilen kadınlardan alınanfraksiyone serumdaki veya srkek plazmasındaki inhibin B profilleri 2 formdan olurken (66 K ve 36 K) dişi serumundaki inhibin A (erkek plazmasında saptanamasada) ek olarak 55 formunu da içermekteydi. Bu bulgular, inhibin B’nin yüksek moleküler ağırlıklı formlarının biyolojik örneklerde mevcut olduğunu ve dağılımlarının inhibin A’nınkinden farklı olduğunu göstermiştir buda dolaşımdaki prekürsör formların farklı şekilde işlendiğini düşündürmektedir. Serum örneklerinde 36K ve 29K’da belirgin pikler yapan pro-alfa C immünoaktivitesi (bilinen pro-alfa C subunit formları) saptandı ve inhibinin herhangibir moleküler ağırlıktaki dimerik formunda saptanmadı. Bu gözlem daha fazla sayıda serum örneğine uygulanırsa proalfa C ELISa serbest alfa subunitinin ölçümü için uygun ve spesifik bir assay sunabilir. Pro-alfa C ELISA ile hFF’de bir 55K piki saptandı, bu ya inhibin dimeri ya da genişlemiş alfa subuniti şeklinde olabilir. Assayler arasındaki immünoaktivite düzeylerini karşılaştırmak için, inhibin A, B ve pro-alfa C standartları bunların alfa C subunit içerikleri bakımından standardize edildi, alfa C subunit içeriği inhibin A veya pro alfa C standardına göre alfa C subunit içeriğinin %60’ını içeren inhibin B standardı ile yapılan bir alfa C subunit immunoassay’i ile belirlendi. alfa C içeriğindeki bu fark için çeşitli standartların uyarlanmasının ardından, kombine inhibin A. B ve pro-alfa C düzeylerinin hFF’deki ve serum kromatogramlarındaki bir kıyaslaması yapıldı ve alfa subunitine yönlendirilmiş immunoassaylerle belirlenen düzeylerle karşılaştırıldı. Yüksek korelasyon (r=0.93) gözlendi, bu da serumdaki alfa subunit immünoaktivitesinin geniş oranda inhibin A, B ve proalfa C’nin bilinen moleküler ağırlık formlarının bir karışımından oluştuğunu göstermekteydi. Şu sonuca varıldı a)hFF’deki inhibin invitro biyoaktivitesi inhibin A ve B’nin 33-36K ve 50-65 K formlarının varlığına büyük oaranda bağlanmaktadır, ancak serumda diğer biyolojik olarak aktif formlar mevcuttur ve b)hFF ve serumdaki inhibin alfa subunit aktivitesi inhibin A, inhibin B ve alfa subunitinin bilinen veya tahmin edilen formlarının (ilave başka bilinmeyen formların varlığı için çok az kanıt vardır) bir karışımıdır.

 

33

Smith, L.C.,Olivera-Angel, M., Groome, N.P, Bhatia, b. and Price, C.A. (1996) Oocyte guality in small antral follicles in the presence or absence of a large dominant follicle in cattle. J. Reprod. Fertil. 106,193-199.

(Sığırlarda büyük bir dominan folikülün varlığı veya yokluğunda küçük antral foliküllerdeki oosit kalitesi - 1996 – J. Reprod. Fertil.)

Bu deneylerin amacı bir dominant folikül varlığının sığırların küçük antral foliküllerindeki oositlerin gelişimsel kompetansını etkileyip etkilemediğine karar vermekti. 1. deneyde, ilk dalga dominant folikülün  ortaya çıkmasından (rektal ultrasonografi ile teyid edildi) önce (östrus siklusunun 3. günü; n=4) veya sonra (östrus siklusunun 6 ve 7. günü; n=6) 2-7 mm çaptaki foliküllerden oositler veya folliküler sıvı örnekleri toplandı. Östrodiol, progesteron, testosteron ve dimerik inhibinin folliküler sıvı konsantrasyonlarının belirlenmesi için 5-10 folikül aspire edildi; her bir ineğin kalan folliküllerinden oositler toplandı ve invitro fertilizasyon ve matürasyon ile gelişimsel kapasite değerlendirildi. İkinci deneyde, genç korpus luteumun bulunduğu ve büyük bir östroen aktif folikülün olduğu yada olmadığı overler toplandı. Herbir over çiftindeki küçük foliküllerden alaınan follikül aspiratlari toplandı ve oosit kalitesi ile steroid konsantrasyonşları belirlendi. 1. deneyde, dominant folikülün ortaya çıkmasından önce eşlde edilen küçük foliküller sonrasında alınanlara göre belirgimn olarak daha fazla östrodiol içermekteydi (sırasıyla 19.5+/-1.5’a karşılık 0.7+/-1.1; p<0.05) ancak progesteron, testosteron veya dimerik inhibinin konsantrasyonlarında önemli değişiklikler yoktu. Dominant folikülün ortaya çıkmasından önce veya sonra toplanan oositlerden elde edilen blastosistlerin yüzdesi anlamlı derecede değişiklik göstermedi (sırasıyla, 12.1+/-9.0’a karşılık 11.8+/-7.=; p>0.05). İkinci deneyde, folliküler steroid konsantrasyonları büyük östrojen aktif folliküllerin varlığında ve yokluğunda alınan küçük folliküllerde farklılık göstermedi ve oositlerin gelişimsel kapasitesinde farklılık yoktu. Folliküler östradiol konsantrasyonu ile iki hücreli embriyo (r=-0.90; P<0.01) ve sekiz hücreli embriyodan (r=-0.65; P<0.05) şekillenen blastosistlerin yüzdesi arasında anlamlı derecede negatif korelasyon vardı. Bu veriler, ineklerde, küçük antral folliküllerden alınan oositlerin gelişimsel kompetanslarının birdominant follikülün varlığından negatif olarak etkilenmediğini düşündürmektedir.

 

34

 

Wallace, E.M., Swanston, I.A., McNeilly, A.S., Ashby, J.P., Blundell, G., Calder,A.A., Groome,N.P. (1996) 2^nd-Trimester Screening for Downs-syndrome Using Maternal Serum dimeric Inhibin-A clinical Endocrinology, 44;17-21

(Down Sendromu için Maternal Serum Dimerik İnhibini kullanan 2. Trimestr Taraması - 1996 – Clinical Endocrinololgy)

GİRİŞ VE AMAÇ

Down Sendromu için prenatal maternal serum taraması modern antenatal bakımın önemli ve oturmuş bir bölümü haline gelmiştir. Daha önceden non-spesifik immunoreaktif inhibinin bu bağlamda yararlı olabileceği bildirilmişti. Yeni bir assayi kullanarak, Down Sendromu’nda olası bir ikinci trimestr marker’ı olarak dimerik inhibin A’yı inceledik.

METOD

1992-1993 kayıtlarından, Down sendromunun olduğu ve kromozomal olarak normal kontrol gebelerden alınan depo serumlar belirlendi ve analiz için alındı. Bu serumlar 15, 16 ve 17. gebelik haftalarında prospektif olarak toplanmıştı.

DENEKLER

Down sendromlu gebeliği olan ve aynı zamanda analiz için serumu bulunan 21 kadından kayıtlar toplandı. Gebelik haftası ve depolama süresine göre eşleştirilmiş kromozomal olarak normal 150 kontrolden alınan serumlar da toplandı.

ÖLÇÜMLER

Dimerik inhibin A yakın zamanda geliştirilmiş olan iki-yönlü ELISA kullanılarak ölçüldü. Bu tetkikte, anti inhibin beta (A)-subunit monoklonal antikorunun (bir mikrotitre plakasına kovalan olarak bağlanmış olan) ve  alkalen fosfatazla konjuge (saptanmasına izin veren) olan ikinci bir anti inhibin alfa subunit antikorunun yakalanması sağlanmaktadır.

SONUÇLAR

Kontrol gebelerden alınan örneklerdeki ortalama maternal serum dimerik inhibin A,15., 16. ve 17. haftalarda, sırasıyla 237 (201.5-273.4) ng/l, 266.9 (235.4-298.5)ng/ml ve 207.2 (178.5-235.9)ng/ml idi. Down örneklerinin sonuçlarını normal medianın katları (MoM) olarak ifade edilmesinde, median (%95 GA) MoM 2.6(2.25-3.57) idi, kontrollerden belirgin olarak daha yüksekti (p<0.0001, Mann Whitney U testi). Test edilen örnek grubunda %5.3’lük bir yanlış pozitif oranı için, inhibin A tek başına %62’lik bir saptama oranı sunmaktaydı ve rutin tarama ile daha önceden saptanamayan olguları ortaya çıkarmaktaydı.

ÖZET