|
TÜBERKÜLOZ TANISINDA YENİ YAKLAŞIMLAR
ve
QuantiFERON-TB Gold Test
Tüberküloz halen tüm dünyada önlenebilir infeksiyon hastalıkları içinde birinci ölüm nedenidir. Dünya nüfusunun üçte birinin tüberküloz basili ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. TB olguları ile temas eden sağlıklı kişilerin %5’inde ilk iki yıl içinde aktif TB, %95’inde ise sessiz infeksiyon yani latent TB infeksiyonu (LTBI) gelişmektedir. Latent olarak enfekte kişilerin % 10’unda da aylar veya yıllar sonra tüberküloz hastalığı gelişme riski vardır. LTBI teşhisinin ana amacı, tüberküloz hastalığının önlenmesi için medikal tedavinin değerlendirilmesidir. Ayrıca infeksiyonun dev global rezervuar özelliğinden dolayı devamlı bir bulaş kaynağı mevcuttur. Fakat kültür için, özellikle çocuklardan, materyal alımının zorluğu ve latent infeksiyonlu sağlıklı kişilerden kültür için örnek alınmasının imkansızlığı, aktif tüberkülozun tanı yöntemlerini ve latent M. tuberculosis infeksiyonunun taranmasını daha da önemli kılmaktadır.
Latent tüberküloz infeksiyonu tanısında 1910 yılından beri tüberkülin cilt testi (TCT) kullanılmaktadır. TCT, Purified Protein Derivative’ye (PPD) hipersensivite cevabını ölçmektedir. TCT’nin en büyük sınırlaması, PPD’de birçok antijen karışımının olması ve M. tuberculosis, M. bovis, Bacille Calmette Guerin (BCG) ve nontüberküloz mikobakteri (NTM) ile aynı antijenleri taşımasıdır. Pozitif TCT gerçek M. tuberculosis infeksiyonunu gösterebildiği gibi BCG veya NTM’ye bağlı pozitifliği de gösterebilir. Ülkemizdeki gibi NTM görülme sıklığının yüksek olduğu ve yüksek BCG aşısı olan popülasyonlarda TCT’nin daha az spesifik olduğu iyi bilinmektedir.
Aktif tüberkülozlu hastalarda da tüberkülin cilt testinin %25 yalancı negatif olduğu görülmüştür. Bu yüksek yalancı negatiflik oranı, beslenme ve genel sağlık durumunun kötü olmasına, yaygın akut hastalığa ya da bağışıklığın baskılanmasına bağlı bulunmuştur.
Tüberkülozun bilinen ilk immunolojik tanı aracı TCT, latent infeksiyon tanısında günümüzde altın standart özelliğini korurken, yukarıdaki olumsuzluklara ek olarak uygulamada iki vizit gerektirmesi, uygulama ve yorumlamadaki hatalar, yorum farklılıklarına, BCG aşılaması ve NTM infeksiyonlarından kaynaklanan yanlış pozitif sonuçlar gibi nedenlerle yanlış negatif ve pozitif sonuçlara yol açma özelliğinden dolayı, daha duyarlı ve özgül tanı araçları geliştirme zorunluluğu doğmuştur. Bu amaçla yapılan çalışmalar sonucunda Early Secreted Antigen Target (ESAT–6) ve Culture Filtrate Protein (CFP–10) gibi antijenler bulunmuştur. Bu antijenlerin tanımlanması TB tanısında büyük bir gelişmedir. Bu proteinler Mycobacterium tuberculosis genomunda ‘region of difference 1 (RD1)’ bölgesinde kodlanmıştır ve BCG ile birçok nontüberküloz mikobakteride bulunmamaktadır (M. kansasii, M.szulgai ve M. marinum hariç). Bunun klinik avantajı, gerçek tüberküloz infeksiyonunu BCG aşılı kişilerde aşı etkisinden ve NTM infeksiyonlarının büyük bir çoğunluğundan ayırt edebilmesidir.
Son yıllarda TCT’ye alternatif olarak, Mycobacterium tuberculosis’e spesifik bu gibi antijenlere cevap olarak memory T–hücrelerinden salınan γ-INF düzeyini ölçen RD1-IFN bazlı testlerin kullanımına başlanmıştır.
T hücre bazlı γ-INF assays kitleri şunlardır:
* Enzyme-linked Immunospot (ELISPOT) T SPOT-TB assay (Oxford Immunotec, Oxford, United Kingdom)
* QuantiFERON-TB (Cellestis International, Carnegie, Australia)
* QuantiFERON-TB Gold assay (Cellestis International, Carnegie, Australia)
Enzyme-Linked Immunospot for Interferon-gamma
ELISPOT assay, M. tuberculosis için spesifik T hücrelerinin tespitine dayalı bir yöntemdir. Duyarlılığı ve özgüllüğü QuantiFERON-TB Gold’a eşit olmakla beraber, gerek çalışmasının zorluğu ve uzunluğu, gerekse değerlendirmedeki güçlük nedeniyle yaygın kullanım alanı bulamamıştır.
QuantiFERON-TB Test
QuantiFERON-TB, T hücreleri tarafından kana salgılanan γ-INF’nın ELISA yöntemiyle ölçülmesi prensibine dayalı bir çalışmadır. Bu çalışmada kullanılan antijenler hem M. tuberculosis hem de M. bovis’te bulunduğu için BCG aşılaması ve NTM infeksiyonlarından olumsuz olarak etkilenebilmektedir. QuantiFERON-TB 2001’ de ABD’ de Food and Drug Administration (FDA) tarafından onaylanmıştır.
QuantiFERON-TB Gold Test
Son zamanlarda, TB tanısı için spesifik ESAT-6, CFP-10 ve TB 7.7 antijenleri bazlı γ-INF testinin değerlendirilmesinde, bu antijenlerin tam kanda TB infeksiyonlarında ve latent TB’ lilerde belirgin olarak arttığı, TB infeksiyonu ile atipik mycobacterial reaksiyon ve BCG aşı reaksiyonu arasındaki ayırımda bunun tanı koymada çok önemli olduğu gösterilmiştir.
Çalışma prensibi, sadece M. tuberculosis’ te olup M. bovis ve birçok NTM’de bulunmayan, ESAT–6, CFT–10 ve TB 7.7 antijenlerini kullanarak invitro ortamda memory T hücrelerinden salgılanan γ-INF düzeyinin ELİSA yöntemi ile ölçülmesine dayanır.
QuantiFERON-TB Gold Testi 10/10/2004 yılında FDA onayı almıştır.
Tüberkülozun tanısı için TCT ucuz bir yöntem olarak kabul edilir. Test için kullanılacak malzemelerin çok ucuz olması bu sanının oluşmasına neden olur. Oysa iki ziyaret ihtiyacı, tekrarlanan testler, test sonuçlarının yorumlanma eksiklikleri ve yanlış pozitif sonuçlar ve bunun sonucu gereksiz tetkik ve tedavi giderleri TCT’nin maliyetini arttırmaktadır. Malzemeler maliyetin ancak % 0,5 ile % 0,9’unu oluşturmaktadır. Geçen yıllarda 2475 sağlık personeli ile yapılan yayınlanmamış bir çalışmada elde edilen sonuçlara göre QuantiFERON-TB Gold’nin sağlık çalışanı başına maliyeti 28,15$ iken TCT’nin kişi başı maliyeti 36,70$ olarak bulunmuştur.
Uyarılar ve Önlemler
* QuantiFERON-TB Gold sonucunun negatif çıkması, M. tuberculosis infeksiyonunun veya tüberküloz hastalığının olmadığını göstermez: yalancı negatif sonuçlar, infeksiyonun aşamalarından kaynaklanabilir (ör: numune hücresel immün cevap oluşmadan alınmış olabilir), bağışıklık fonksiyonlarını etkileyen hastalık durumları, kan alımını takiben tüplerin hatalı kullanılması, testin hatalı çalışılması ve diğer immünolojik değişimler.
* QuantiFERON-TB Gold sonucunun pozitif çıkması, M. tuberculosis infeksiyonunun belirlenmesinde tek başına yeterli değildir. Testin hatalı çalışılması yalancı pozitif sonuç verebilir.
* Pozitif bir QuantiFERON-TB Gold sonucunda, aktif tüberküloz hastalığı için, daha ileri tanısal değerlendirmeler yapılmalıdır (ör: ARB yayma ve kültür, akciğer grafisi).
* ESAT-6, CFP-10 ve TB7.7 antijenlerinin hiçbir BCG aşısında ve bilinen tüberküloza sebep olmayan mikobakterilerde bulunmamasına rağmen, M. kansasii, M. szulgai veya M. marinum infeksiyonları yüzünden QuantiFERON-TB Gold sonucu pozitif çıkabilir. Böyle bir infeksiyon şüphesi varsa, alternatif testlerle araştırılmalıdır.
Sonuç olarak:
QuantiFERON-TB Gold M. tuberculosis’in neden olduğu infeksiyonun tanısı için kullanılan bir testtir. Hem aktif hastalık hem de latent hastalık döneminde tanı koydurucudur. Test, T hücrelerinin spesifik antijenler ile uyarılması, T lenfositlerinin bu uyaranlara γ-INF salınımı ile cevap vermesi ve γ-INF miktarının ölçülmesine dayanır.
Testte kullanılan ESAT-6, CFP-10 ve TB 7.7 antijenleri, BCG suşlarında ve M. tuberculosis dışındaki suşlarda bulunmadığı için test M. tuberculosis’e spesifiktir. Test BCG antijenleri ile reaksiyon vermediği için aşıya bağlı immun yanıtı göstermez. Sadece M. tuberculosis’in neden olduğu infeksiyonda reaksiyon verir.
Quantiferon-TB Gold tüberküloz hastalığı tanısında, klinik, radyolojik ve diğer bulgulara yardımcı olarak kullanılan önemli bir tamamlayıcıdır. TCT gibi yalancı pozitiflik göstermediği için tüberküloz taramalarında spesifikliği TCT’ye göre çok yüksektir.
|
Performans ve Operasyonel
Özellikler
|
Tüberkülin Cilt Testi (TCT) (PPD) |
RD1 bazlı İNF-γ
(QuantiFERON-TB Gold) |
|
Numune şekli |
Cilt içine PPD enjekte edilir. Uygulanması zordur, deneyim ister. |
Tam kandan çalışılır. Örnek alımı kolaydır. |
|
Sensitivite
(Aktif tüberkülozlu hastalarda) |
%75-%90
(İmmun yetmezliği olan popülasyonlarda daha düşük) |
%80-%90
(İmmun yetmezliği olan populasyonlar için yeterli bilgi yok) |
|
Spesifisite
(TB hastalığı veya teması olmayan sağlıklı bireylerde) |
%70-%95 |
%95-%100 |
|
BCG ve Non tüberküloz mikobakteriler (NTM) ile çapraz reaksiyon |
Var |
Yok
(M. kansasii, M.szulgai ve M. marinum hariç)
|
|
M. tuberculosis’e temasla
korelasyonu |
Var |
Var |
|
Güvenilirlik (tekrarlanabilirlik) |
Orta seviyede |
Yüksek |
|
Booster reaksiyonu |
Evet, tekrarlanan testlerde
görülebilir. |
Yok |
|
Hasta ziyareti |
Hastanın iki defa laboratuvara gelmesi gerekir. Hastaların bir kısmı okuma için geri dönmez. |
Hasta sadece bir defa kan vermek için gelir. |
|
Cevap alma süresi |
Sonuç için 48-72 saat gerekir |
24 saat içinde sonuçlanır |
|
Test değerlendirilmesi |
Subjektiftir.
Okuyanlar arasında çelişkiler olabilir. Sınır değerler algılamalara göre değişir. |
Objektiftir.
Sonuçlar var veya yok şeklinde verilir. ELISA okuyucusunda değerlendirilir |
|
Çalışma şekli |
In vivo bir testtir |
In vitro bir testtir |
TÜBERKÜLOZ TANI YÖNTEMLERİ
TB tanısında 2000’ li yıllarda yeni gelişmeler kaydedilmiştir. Halen TB tanısında adı geçen tanı yöntemleri şunlardır:
I. BAKTERİYOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ
Smear Mikroskopisi:
Boyama metodları karbolfuksin ve florokrom metodları olarak ikiye ayrılır.
* Karbolfuksin metodları; Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) ve Kinyoun
* Florokrom metodları; Auramin–0 ve Auramine-rhodamine
Florokrom boyama sonrasında inceleme flüoresan mikroskopta yapılır.
Direk balgam mikroskopisinde en önemli sorunlar yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlardır.
Yanlış pozitif sonuçlar:
Balgamdaki yemek artıkları, boya parçacıkları, saprofit aside dirençli bakteriler, atipik mikobakteriler, nokardia, çam poleni, iplikçik, lamdaki çizikler, başka balgamdan bulaşma, imersiyon yağı ile bulaşma, aynı lamın tekrar kullanımı.
Yanlış negatif sonuçlar:
Balgam toplanmasındaki yetersizlikler, balgam örneklerinin ve boyanmış preparatların uygunsuz korunmaları, homojenize edilmeyen balgamda uygun yerden örnek alınmaması, tekniğe uygunsuz boyama, okuma hataları.
Fluorokrom metodu karbolfuksin metodundan çok daha duyarlıdır. Ancak pahalı cihazlara ihtiyaç vardır. Ayrıca yalancı pozitifliğinin diğer yönteme göre fazla olmasından dolayı, floresans mikroskopunda pozitif olarak saptanan preperatların Ziehl-Neelsen yöntemi ile konfirme edilmesi önerilmektedir.
Her iki yöntem ile de canlı organizmalar ayırt edilemez ve tip ayrımı yapılamaz.
Kültür ile boyamanın duyarlılığı karşılaştırıldığında ARB boyamanın duyarlılığı %22-78 olarak bildirilmiştir.
Smear mikroskopisinde aynı gün sonuç alınmaktadır
Pozitifliğin saptanabilmesi için örnekte 5000-10000 basil/ml bulunması gerekir.
Kültür:
Kültür yöntemleri tüberküloz tanısında halen altın standart olmaya devam etmektedir.
Mikobakteri kültür yöntemlerini klasik katı besiyerleri ve hızlı kültür yöntemleri olarak ikiye ayırmak olasıdır.
A-Katı Besiyerleri
TB basili bu sistemlerde yavaş ürer. Bugün en yaygın kullanılan, Löwenstein-Jensen (LJ) besiyeridir. Ayrıca bu grupta Petragani ve American Trudeau Society gibi besiyerleri de bulunmaktadır.
B-Hızlı Kültür Yöntemleri
Hızlı kültür yöntemlerinin esası sıvı besiyerleridir. Sıvı kültürler ile mikobakterilerin saptanması katı besiyerlerinden yapılan klasik kültür yöntemlerine göre daha kısa sürede ve daha yüksek duyarlılıkta olmaktadır.
Otomatize hızlı kültür yöntemleri:
* BACTEC TB-460 system (Becton Dickinson, Sparks, MD)
* BACTEC MGIT 960 system (Becton Dickinson, Sparks, MD)
* VersaTREK (Eski adlandırılması ESP system II) (Trek Diagnostic)
* BacT/Alert 3D (Eski adlandırılması MB/BacT) (BioMérieux)
Basilin saptanabilmesi için örnekte 10 – 100 canlı basil/ml bulunması yeterli olduğundan, smear mikroskopisinden daha duyarlıdır.
II. MOLEKÜLER YÖNTEMLER
Tüberküloz tanısında kullanılan moleküler testler, hızlı ve özgüllükleri yüksek olmakla birlikte duyarlılıkları kültürden düşüktür.
Tüberkülozun moleküler tanısında genellikle nükleik asitteki hedef bölgenin çoğaltılması esasına dayanan yöntemler kullanılmaktadır.
1. Nukleik Asid Amplifikasyon Metodları
1.1 In house PCR
Yöntem; nükleik asitlerin istenilen bölgelerinin, bölgeye özel, sentetik oligonükleotid primerleri kullanılarak, in vitro ortamda kopyalanmasını esas alır. Hedef olarak rRNA veya genomik DNA’nın ayırıcı özellik taşıyan farklı bölgeleri kullanılabilir. Kopyalama işlemi kısa sürer. Bu büyük bir avantajdır. Yöntemin bir diğer avantajı, az miktarlarda (picogram (pg) seviyesinde) hedef molekül olduğu hallerde dahi sonuca gidebilmektir. PCR için, mililitrede 10 basil bulunması tanı için yeterli olmaktadır. Burada en önemli dezavantaj, DNA kontaminasyonudur. DNA dayanıklı bir moleküldür. Laboratuvar uygulamaları sırasında aerosol ile reaksiyona girerek, yalancı pozitiflik yaratabilir. Bununla birlikte, çalışılan materyalin türüne göre, PCR’ın inhibe olması söz konusu olabilir ki bu da yalancı negatif sonuçların ortaya çıkmasına neden olur.Yapılan çalışmalar, doğrudan PCR uygulaması kullanıldığı takdirde yalancı negatiflik ve pozitiflik oranlarının yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Sonuçlar klinik bulgular ve diğer laboratuvar yöntemleri ile bir arada değerlendirilmelidir. Yapılan çalışmalarda duyarlılık ve özgüllüklerin %2-90, yalancı pozitifliklerin ise %3-77 oranında değiştiği saptanmıştır.
1.2 Ticari Amplifikasyon Metodları
PCR’da kontaminasyon riskini ortadan kaldırabilmek ve moleküler çalışmalarda duyarlılık yüzdelerini arttırabilmek amacı ile yeni yöntemler geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla in house sistemlerden sonra ticari sistemler de geliştirilmiştir. Ticari sistemlerin kontaminasyon riskinin daha az olması, miktar belirlenebilmesi, daha duyarlı olması ve otomatizasyon kapasitelerinin olması gibi avantajları vardır. Ancak bu sistemlerinde halen standardizasyon sorunları vardır. Bu sistemler şunlardır:
* Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTD) (Gen-Probe) (San Diego, CA, USA)
* Amplicor MTB Test (Roche Molecular Systems, Basel, Switzerland)
* BD ProbeTec ET (Becton Dickinson, Sparks, MD)
1.3 Real-time PCR
TB tanısında PCR da yaşanan sorunların çözümü için için Real-time PCR, oldukça yararlı görünmektedir. Bu sistem kapalı sistem olduğu için carry over kontaminasyon problemi en aza inmiştir. Aynı anda kalitatif ve kantitatif değer elde edilebilmektedir. Alet maliyeti katılmazsa test maliyeti klasik PCR ile aynıdır. Ayrıca yeni sistemler daha az flouresan boya kullandıkları için çevreyi daha az kirletmektedirler. Kısa sürede sonuçlanma avantajına sahiptirler. Yeni sistemlerin dezavantajı ise çoğunlukla cihaz ve sarf malzemesi bağımlı olmaları ve henüz tam standardize edilememeleridir.
2. Genetik İdantifikasyon Metodları
2. 1 PCR Restriction-enzyme Analizi
2. 2 DNA Probes
* AccuProbe
* Line probe assays: INNO-LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics, Ghent, Belgium)
GenoType Mycobacterium (Hain, Germany)
GenoType MTBC (Hain, Germany)
2. 3 Genetik Sequencing
3. FenotipikTanı Metodları
3. 1 Phage-based Assays: FASTPlaque TB Assay
3 .2 Mikro-koloni Metodu
3. 3 Microscopic observation broth-drug susceptibility Assay (MODS)
3. 4 Hücre Duvarı Mikolik Asid Tespiti
* Thin-layer Chromatography (TLC)
* Gas-Liquid Chromatography (GLC)
* High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Moleküler testlerin klinik örnekte tüberküloz varlığının saptanmasında, ARB mikroskopisi ve kültür ile birlikte uygulanması önerilmektedir.
Laboratuvar tanıda moleküler ticari sistemler;
* TB şüpheli hastaların, özellikle yayma (+) solunum örneklerinde
* Hastalığın eradikasyonu için mücadelede,
* Tedavinin takibi ve yönlendirilmesinde, etkili görünmektedir.
* Mevcut ticari ürünler asla tarama amaçlı kullanılmamalı,
* Referans laboratuvarlarda kurulmasına önem verilmeli,
* Konvansiyonel yöntemlerin altın standart olduğu unutulmamalı
III. SEROLOJIK TANI YÖNTEMLERİ
Tüberküloz tanısı için altın standart bakterinin gösterilmesi ve üretilmesidir. Fakat gerek hastalığın doğasından, gerekse, özellikle çocuklarda, materyal alımının zorluğundan dolayı, bu bazen imkansız olabilir. Bu yüzden tanı için farklı yöntemler geliştirilmeye çalışılmıştır.
Bu yöntemlerden birisi de şu anda dünyada en çok kabul gören QuantiFERON-TB Gold testidir.
LABORATUVARIMIZDA TÜBERKÜLOZ TANISINDA YAPILAN TESTLER
* EZN ile ARB aranması
* Fluoresen (Florokrom) yöntemle ARB aranması
* Konvansiyonel (Löwenstein-Jensen) yöntemle Tbc Kültürü
* BACTEC TB-460 yöntemiyle Tbc kültürü
* Moleküler (Real-time PCR) yöntemle Tbc aranması
* QuantiFERON-TB Gold Test
|
