İnvaziv Aspergillus Enfeksiyonlarının Tanısı
ve
Galaktomannan Antijeni
Son birkaç dekatta invaziv mantar enfeksiyonlarının sıklığı dramatik biçimde artmıştır. Bu artışın nedeni immun eksikliği olan hastaların sayısında artış, geniş spektrumlu antibiyotiklerin yaygın kullanımı ve mantar hastalıklarının varlığından daha fazla kuşkulanılmasıdır. İnvaziv mantar hastalıklarında erken tanı uygun tedaviye yol göstermesi ve mortaliteyi önlemesi bakımından önemlidir.Yeni antifungal ilaçların bazı mantarlara spesifik etkisinin bulunması da erken tanının önemini ortaya koymaktadır.
Aspergillus enfeksiyonları genellikle çevre ortamda bulunan Aspergillus sporlarının inhalasyonu ile meydana gelir. Özellikle son 10 yıl içinde artış gösteren invaziv formlar ciddi enfeksiyonlara yol açar. Enfeksiyon en sık A. fumigatus ile oluşur.
İnvaziv Aspergilloz (İA) tek tük olgular halinde normal konaklarda da bildirilmişse de esas olarak bağışıklığı bozuk hastalarda, özellikle hematopoetik kök hücre transplantlılarında ve hematolojik maligniteli hastalarda görülmektedir ve olgu-fatalite oranı yüksektir (≥%90).
İA’ un tanısında altın standart steril bir vücut bölgesine ait örneğin doğrudan mikroskopta incelenmesiyle Aspergillus varlığının gösterilmesi ve kültürde mantarın üretilmesi ve/veya histolojik incelemedir. Tanı için biyopsi materyelinin alınması hastanın genel durumunun iyi olmayışı, trombositopeni gibi nedenlerle genellikle mümkün olamamaktadır. Bu olgularda klinik tablonun özgül olmaması, semptomların hastalığın erken aşamalarında belirgin olmaması ve kültür sonuçları çıkana kadar geçen süre tedavide önemli gecikmelere yol açmaktadır. Bu nedenle erken tanı için geliştirilen testler özellikle kritik hastalarda tedavinin yönlendirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır.
Klinik bulgular: Spesifik değildir.
Radyolojik bulgular: Özellikle nötropenik çocuklarda ve erken dönemde normal olabilir. Akciğer grafisinde soliter veya multipl pulmoner nodul veya düşük dansiteli zon ile çevrili lezyonlar (halo belirtisi), plevraya dayalı küçük lezyonlar immun eksikliği olan hastada aspergillozu düşündürmelidir. Kısa süreli gözlenir ve bir hafta içinde kaybolur.Bu nedenle aspergillus tanısı bakımından infeksiyonun ilk 5 günü içinde BT yapılmalıdır. Serolojik testler pozitifleşmeden bu belirti gözlenebildiğinden tanı bakımından önem taşır. Kavite gelişimi ve ay şeklinde hava (air crescent) belirtisi ise ancak hastalığın 3. haftasında görülür.
Konvensiyonel yöntemler:
Direkt incelemeler: Kültüre göre avantajı sensitivitesinin yüksek oluşu ve rölatif olarak hızlı oluşudur. Dezavantajı diğer filamentöz mantarları (penisillium gibi) kesin olarak ayırt ettiremeyişidir.
Kültür: Antifungal direncin saptanabilmesi gibi avantajı, üremenin zaman alması ve tür belirlemek için uzman gerektirmesi gibi dezavantajları vardır.
Histopatolojik inceleme: Tanı için gereklidir ancak hastanın genel durumunun iyi olmaması nedeniyle sıklıkla yapılamaz.
Yeni tanı yöntemleri:
Antikor saptama: Anti-Aspergillus antikorlarını belirlenmenin nötropenik hastalarda ve hematopoetik kök hücre transplantlılarında aspergilloz tanısı bakımından yeri yoktur. Çünkü bu hastalar uygun antikor yanıtı üretemezler.
Antijen saptama:
Galaktomannan: GM antijeni bir eksoantijendir; mantarın hücre duvarı yapısında bulunmakta; in vitro ve in vivo gelişme sırasında ortama salınmaktadır. GM antijeni saptanması, hem erken tanı konmasında faydalıdır hem de galaktomannan antijenemisinin seri halinde degerlendirilmesi tedavi izlemini kolaylaştırabilir.
Aspergillus antijeni aramak için geliştirilmiş ve ticarette bulunan bir lateks aglütinasyon (LA) kiti (Pastorex Aspergillus, Sanofi, Diagnostics Pasteur, France) bulunmaktadır. Bu çalışmada sıçan monoklonal EB-A2 antikorlarını kullanmaktadır. Pastorex Aspergillus LA kiti ile serumda GM antijeninin belirlenebilir alt sınırı 15 μg/ml’dir. Bu testin duyarlılığı çok düşüktür.
Galaktomannan ölçümü için çeşitli yöntemler varsa da son yıllarda Avrupada ve A.B.D 'de monoklonal antikorlarla yapılan Platelia Elisa (Platelia Apergillus EIA, BioRad) yöntemi kullanılmaktadır. Aspergillus Platelia enzim immunassay (EIA), bir galaktofuranoz epitopa karşı monoklonal antikorla sandviç EIA’de GM belirlenmesi prensibine dayanmaktadır.
Mayıs 2003’den bu yana Amerika’da Food and Drug Administration (FDA) onayı olan kitin cut-off değeri 0.5ng/ml’dir.
Çalışmalarda, GM antijeninin serumda hastalığın erken aşamasında, İA’a işaret eden klinik bulgular ortaya çıkmadan ve radyolojik özellikler saptanmadan önce belirlenebildiği ve tekrarlanan deneylerde negatif sonuç alınıyorsa İA riskinin düşük olduğu gözlenmiştir. Aspergillozun klinik belirtileri ortaya çıkmadan 3-4 gün önce sirküle eden galaktomannan saptanabilmektedir.
Yapılan çalışmalarda testin İnvazif Aspergillus infeksiyonlarında
Duyarlılığı % 67 –100
Özgüllüğü % 81 –99
Yalancı pozitifliği % 6 –14 (yetişkinlerde) (Pediatrik vakalarda % 80’lere varan yalancı pozitiflik) olarak bulunmuştur.
Yalancı Pozitiflik:
Subklinik infeksiyon,
Sindirim sisteminde kolonizasyon,
Siklofosfamid ile çapraz reaksiyon
Bazı antibiyotikler (ampisilin-sulbaktam, amoksisilin-klavunat, piperasilin-tazobaktam),
Otoreaktif antikorlar,
Böbrek yetmezliği,
Özellikle çocuk hastalarda kontamine gıdaların yenilmesi ve diğer küflerle çapraz reaksiyonlar (GM antijeninin canlı mantar bulunmasa bile kontamine havadan veya yiyeceklerden alınabildiği düşünülmüş ve yapılan çalışmalarda hastane mutfağındaki elemanlarda, markette satılan sebzelerde, pastada, pirinçte ve kemik iliği transplantlıların (KİT) dışkısında GM antijeni pozitifliği gösterilmiştir.),
Bifidobacterium türleri (süt ve süt ürünleri) (Yalancı pozitif GM antijeni sonuçlarıyla özellikle yenidoğanlarda ve pediatrik hasta grubunda karşılaşılmaktadır. Bifidobacterim sp’nin bir lipoteichoic asidinin molekül yapısı benzerliğinden ötürü, Platelia EIA’da kullanılan monoklonal antikor için bir epitop gibi davranabildiği kuramlaştırılmaktadır. Yenidoğanların barsaklarında Bifidobacterim sp’nin yoğun bir şekilde kolonize olduğu ve bağırsak mukozasının olgunlaşmamış olması dolayısıyla lipoteichoic asidin seruma geçebileceği hipotezi öne sürülmüştür.),
Nötropenik hastalarda stafilokoklar, enterokoklar, Corynebacterium jeikeum, Pseudomonas, Echerichia coli’den ileri gelen bakteriyemiler.
Kemik iliği transplantasyonunu izleyen ilk 30 günde ve sitotoksik kemoterapinin başlamasından 10 gün sonra yalancı pozitif sonuçlar alınabilir. Bunun büyük olasılıkla bağırsak mukozasının kemoterapi veya radyasyonla yıkıma uğraması sebebiyle gıdalarla alınan GM antijeninin fazla absorpsiyonuna bağlı olduğu öne sürülmüştür.
Yalancı Negatiflik:
Sınırlı anjioinvazyon,
Yüksek antikor titresi,
Düşük fungal yük,
Mantarın düşük galaktomamnnan açığa çıkarması,
Mantarın büyüme fazı,
Mikro çevre,
Konakçı immun durumu,
Anti-aspergillus antikor varlığı.
Bu kısıtlamalara rağmen özellikle yüksek infeksiyon riski taşıyan hastalarda galaktomannan antijeneminin seri ölçümleri erken tanı ve tedavi açısından büyük önem taşımaktadır. Ölçümün performansı birçok faktöre bağlı olduğu için invaziv hastalık düşünülüyorsa düzey hemen belirlenmeli ve sonra haftada 2 kez örnek alınmalıdır. GM antijeninin doğal olarak kandan hızla temizlenmesi sebebiyle de seri serum örnekleriyle çalışılması önem taşımaktadır. Haftada iki veya üç kez ardışık test pozitifliği duyarlılık ve özgüllüğü artırmaktadır. Seri örneklerde GM pozitifliğinin belirlenmesi hastanın durumuna göre bir hafta ile iki ay arasında değişebilmektedir. Nötropenisi olmayan hastalarda duyarlılık daha düşük bulunmuştur.
İA’da serum GM düzey takibi, antifungal tedavinin başarısı ve prognoz açısından da bilgi verebilir.
Çalışmalar antijenemi düzeyinin hastalığın seyri sırasında arttığını, azalan antijen düzeyinin iyi bir prognoza işaret ettiğini göstermektedir. En yüksek yoğunluğa hastalığın son aşamalarında ulaşılmaktadır. Galaktomannan antijeninin aranması hastaların takiplerinde de umut verici olarak görülmekte ve antijeneminin ortadan kalkması iyi, devam etmesi ise kötü klinik progresyon ile korale bulunmaktadır.
Yalancı pozitif sonuçların azaltılabilmesi bakımından, pozitif bir testin belirleyiciliği için art arda iki serum örneği ile çalışılması önerilmişse de yine yalancı pozitif sonuç oluşabileceği unutulmamalıdır. Bu nedenle klinik ve özellikle erken dönemde BT bulguları ile birlikte değerlendirme yapılmalıdır.
GM antijeni serum dışındaki vücut sıvılarında da belirlenebilmekte ve bazı durumlarda elverişli olabilmektedir. BAL sıvısında GM antijeni belirlenebilmektedir, ancak solunum yolu kolonizasyonunun yalancı pozitif sonuçlara sebep olabildiği bildirilmiştir. BAL sıvısında GM antijenini EIA yöntemi ile belirleyen bir çalışmada serum ve BAL sonuçları arasında korelasyonun mükemmel olduğu; ancak serum pozitifliğinin bronkoskopiden 30 gün kadar daha önce ortaya çıktığı belirlenmiştir.
Dissemine Aspergillozlu hastalarda Merkez Sinir Sistemi (MSS) tutulumunu ortaya çıkarmak için beyin omurilik sıvısı (BOS)’nda antijen belirlenmesi ile ilgili bildirimler bulunmaktadır. Ancak kontrol amaçlı çalışılan MSS tutulumu bulunmayan pulmoner aspergillozlu hastaların da BOS’nda antijen bulunabilmektedir. Serumda antijenemi yokken BOS’da bulunduğunun belirlenmesi, klinik durumun da uygun olması halinde MSS tutulumuna işaret edebilir.
Antijen idrarda da belirlenebilirse de duyarlılığı serumdan daha düşüktür.
Santral sinir sistemi aspergillozu olan hastalardan alınan BOS örneklerinde ve invazif pulmoner aspergillozlu hastalardan alınan bronkoalveolar lavaj sıvı örneklerinde galaktomannan antijeni saptanmasına yönelik araştırmalar sürmektedir.
Bir çalışma da da GM antijeninin infeksiyon yerinde bulunabilirken serumda bulunmayabildiği gösterilmiştir. Ayrıca, infeksiyon apse şeklinde olduğunda kanda Aspergillus DNA’sının da bulunmadığını gösteren çalışmalar da bulunmaktadır.
(1,3)-beta-D-glukan antijen testi: Zygomycetes ve Criptococcus türleri dışındaki küf ve maya mantarlarının hücre duvarında bulunan (1,3)-beta-D-glukan antijeninin kanda araştırılması hematolojik maligniteli hastalarda duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek bir tarama testi olarak önem kazanmıştır.
Horseshoecrab olarak bilinen deniz canlısının kan hücrelerinden (Amebocyte) elde edilen Limuluslizat’ın beta glucan ile reaksiyonu temeline dayanır.
ABD orijinli Glucatell™(Associates of Cape Cod, US) ile AML grubu nötropenik hastalarda yapılan iki çalışmada duyarlılık %100 özgüllük %80-94 olarak bulunmuştur. Fungal infeksiyonların klinik tanısından ortalama 4-12 gün önce test pozitifleşmektedir. Yalancı pozitiflik değerleri oldukça düşüktür (≤%7).
Serumda (1,3)-beta-D-glukan antijeninin bulunması fungal invazyonun göstergesidir.
Dezavantajı; bir mantar türüne SPESİFİK olmaması (Aspergillus dahil), hücre duvarlarında çok düşük düzeyde BG olan Zygomycetes ve Cyptococcus infeksiyonlarında test sonucunun genelde negatif saptanmasıdır.
Kontamine kan toplama tüpleri, gazlı bezler, kan ürünlerinin hazırlanmasında kullanılan filtreler ve çeşitli antibiyotikler (bazı sefalosporinler, karbapenemler ve ampisilin-sulbaktam) yalancı pozitif sonuçlara yol açabilir.
İnvazif mantar infeksiyonları açısından yüksek risk altındaki populasyonlarda testin güvenilirliği daha fazla çalışma ile doğrulanmalıdır.
Nukleik asid testleri:
İnvaziv mantar infeksiyonlarının moleküler tanısı (PCR) çok ümit vericidir, çünkü fungal DNA'nın hastanın kanında saptanmas konvansiyonel metotlara göre çok erken olmaktadır. Testin standardizasyonu henüz yapılamamıştır. Sensitivitesi %79-100, spesivitesi %81-93 olarak bazı çalışmalarda bildirilmektedir. Kan, BAL, doku, parafin kesitler kullanılabilir. Dokuda PCR kültürden daha sensitiftir. BAL da saptanması kolonizasyon ve hastalığı ayırdettirmez. PCR klinik sensitivitesi antifungal tedavi ile etkilenebilir. Hastanın aldığı sıvı ve ilaçlar PCR' ın nonspesifik inhibitörü olabilir. Real-time metotlar kantitatif özelliklere de sahip olduğundan hem tanı hem de tedaviye yanıtı izlemede önemlidir.
Mikroaarray teknoloji hızlı idantifikasyon mümkündür ve bu konuda çalışmalar yapılmaktadır.
Laboratuvarımızda İnvaziv Aspergilloz (İA) tanısı için Serumda Galaktomannan Antijeni çalışması yapılmaktadır.
| 
