TÜBERKÜLOZ
Tüberküloz insanlığın en eski sorunlarından biridir. Eski Hindu metinlerinde tüberkülozdan Rogaraj (hastalıkların kralı) ve Rajayakshma (kralların hastalığı) olarak bahsedilir. Tüberküloz, tanı ve tedavideki ilerlemelere karşın, bugün de dünyada, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, yaygın olarak bulunan enfeksiyonlardan biridir. Dünya Sağlık Örgütü, 1993 yılında tüberküloz için acil durum ilan etmiştir. TB’ nin sebep olduğu iş gücü, ekonomik kayıplar ve ölümler, bu probleme daha ciddi yaklaşmak gereğini göstermiştir. TB’ nin bu denli sorun olmasında tanıya geç ulaşılmasının büyük payı vardır.
Geleneksel kültür yöntemleri (Löwenstein ve diğer katı besiyerleri gibi) ile tanıya ulaşmak için 6-8 hafta gibi bir süreye ihtiyaç duyulması üzerine, hızlı-sıvı kültür yöntemleri geliştirilmiştir. Günümüzde BACTEC 460 TB Sistemi; mikobakteriler için kullanılan sıvı kültür sistemleri içinde güvenilirliği ve üstünlüğü kabul edilmiş tek sistem durumundadır ve yeni kültür sistemlerini değerlendirmek için kullanılan çalışmalarda referans sistem olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemde Mikobakteri üreme süresi ort. 10-12 gündür. Bu süre örneğin ml’ sinde bulunan basil sayısına ve canlılığına bağlı olarak 1 – 2 güne kadar düşebilir. Kültür, bakterilerin canlılığını doğrudan göstermesi; daha sonra tip tayini ve direnç testlerinin çalışılmasını mümkün kılması açısından da önemlidir.
Yapılan çalışmalarda tek başına BACTEC ile izolasyon oranı % 84 – 100; tek başına L-J ile izolasyon oranı % 48 – 92.5 arasında bulunmuş; BACTEC + L-J’ nin beraber çalışılması ile izolasyon oranının % 100’ lere çıktığı gösterilmiştir. Günümüzde sıvı ve katı sistemlerin kombine çalışılması, mikobakteri izolasyonunda ‘’Gold Standart‘’ olarak kabul edilmektedir. CDC, mikobakteri kültürü için, her örnekte sıvı ve katı besiyerlerinin mutlaka birlikte çalışılmasını önermektedir.
TÜBERKÜLOZ TANISINDA SON GELİŞMELER
VE
BACTEC 460 TB SİSTEMİ
Tüberküloz Mycobacterium genusunun bir üyesidir. Mycobacteria türleri genel olarak hızlı üreyenler ve yavaş üreyenler şeklinde ikiye ayrılır. Kültüre edilemeyen birkaç tipi de vardır (M. leprae gibi). Sadece klinik açıdan bakarsak Mycobacteria 3 ana gruba bölünür:
1) Kesin patojenler
2) Çevrede non patojen olarak yaşayan ama oportunistik enfeksiyonlara da yol açabilenler
3) Non patojen veya çok nadir hastalık sebebi olanlar
Mikobakteriler; ince bazen hafif kıvrık, ortalama 1 – 4 mikrometre uzunluğunda ve 0.3 – 0.6 mikrometre eninde, hareketsiz, sporsuz, kapsülsüz, çomakçıklardır. Hücre çeperi lipidlerden zengindir. Bu lipidlerin bakterinin boyanma özelliklerinde rolü vardır. Mikobakteriler kuruluğa çok dirençlidirler. Örneğin kuru balgamda gün ışığı olmadığı taktirde 6 – 8 ay canlı kalabilirler. Ultraviyole ışınlarına, basınçlı buharla sterilizasyona, pastörizasyona, sodyum hipoklorit, % 70 alkol, % 5 fenol, povidon-iyodin’ e duyarlıdırlar.
TÜBERKÜLOZDA TANI YÖNTEMLERİ
Tüberküloz hastalarının erken tanı ve tedavisi bu hastalıktan toplumun korunmasında en etkili yoldur. Bu nedenle tüberküloza yakalandığı düşünülen hastaların tanılarını kanıtlayacak, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek, hızlı sonuç veren, uygulaması kolay ve pahalı olmayan laboratuvar yöntemlerinin günlük kullanıma girmesi önemli bir gereksinimdir.
DİREKT MİKROSKOPİK İNCELEME
Hazırlanan preperatların incelenmesi için ilk kullanılan boya yöntemi Ziehl-Neelsen yöntemidir. Ziehl-Neelsen yönteminin temeli 1883 yılında Paul Ehrlich tarafından bulunmuştur. Daha sonra Ziehl ve Neelsen tarafından modifiye edilmiştir.
Zamanla yeni boyama yöntemleri geliştirilmiştir. Günümüzde iki tip aside dirençli boyama vardır:
• Ziehl-Neelsen ve Kinyoun prosedürlerini içeren karbol-fuksin metodu
• Auramine O veya auramine-rhodamine boyaları ile yapılan fluorokrome metodu
Fluorokrome metodu karbol fuksin metodundan çok daha duyarlıdır. Ancak pahalı cihazlara ihtiyaç vardır. Ayrıca yalancı pozitifliğinin diğer yönteme göre fazla olmasından dolayı, floresans mikroskopunda pozitif olarak saptanan preperatların Ziehl-Neelsen yöntemi ile konfirme edilmesi önerilmektedir. Ama her iki yöntem ile de canlı organizmalar ayırt edilemez ve tip ayrımı yapılamaz.
Klinisyen, direkt mikroskopide ARB pozitifliğine karşın uyanık olmalıdır. Çünkü Rhodococcus, Nocardia, Legionella micdadei, Cryptosporidium kistleri, Isospora ve Cyclospora gibi organizmalar da bu boyalar ile boyanabilir ve pozitif olarak saptanabilirler.
Direkt Mikroskopik İncelemenin Duyarlılığını Etkileyen Faktörler:
• ml‘ye düşen basil sayısı: Direkt mikroskopik incelemede aside dirençli basilin görülebilmesi için örnekte 5 000 -10 000 basil/ml olması gerekmektedir. Mikobakterilerin kültürde üremesi için ise 10 - 100 basil / ml olması gerekmektedir. Bu da direkt mikroskopik incelemenin duyarlılığının daha düşük olmasını ve kültürün önemini açıklamaktadır.
• Klinik tablo: Yapılan bir çalışmada duyarlılığın lokal enfeksiyonu olan olgularda % 32, kaviter tüberkülozu olan olgularda % 52 olduğu gösterilmiştir. Başka bir çalışmada AIDS + tüberkülozu olan hastalarda % 45; sadece tüberkülozu olan hastalarda % 81 duyarlılık saptanmıştır.
• Deneyim: Preperatı inceleyen kişinin deneyimli olması duyarlılığı arttırmaktadır.
• Değerlendirilme süresi: Bir preperatın en az 15 dakika incelenmesi duyarlılığı arttırmada etkili bir faktördür.
• Toplam yayma sayısı: Bir hastadan birden fazla örnek alınması; aynı örnekten birden fazla preperatın hazırlanıp incelenmesi duyarlılığı olumlu yönde etkilemektedir.
• Kullanılan yöntem
• Santrifüj hızı
• Örneğin cinsi ve kalitesi
Yapılan çalışmalarda duyarlılık oranları balgam’ da % 33-81; BOS’da % 30; idrar’ da % 20-30; plevral sıvı’ da % 20 olarak bulunmuştur. Direkt mikroskopik inceleme ideal koşullarda dahi duyarlılığı düşük bir yöntemdir. Özgüllük ise çoğu zaman % 99 ‘ un üzerinde bulunmaktadır. Ayrıca boyama sistemi kesin tanı için uygun değildir. Bakterinin tipi ve canlılığı hakkında fikir vermez.
Direkt mikroskopik incelemenin boyama yöntemleri ile yapılmasının duyarlılıklarının düşük olması nedeni ile yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmuştur. Bu amaçla yapılan çalışmalarda iki yöntem üzerinde durulmaktadır:
SİTOSANTRİFÜJLEME YÖNTEMİ (Lam-santrifüj-cytospin Yöntemi)
Balgamın smear için hazırlanmasında santrifuj, örneği yoğunlaştırmak için önemli bir aşamadır. 1993 yılında Saceanu , 1995 yılında Fodor; örneği sitosantrifüj yöntemi ile yoğunlaştırmanın duyarlılığı arttırdığını göstermişlerdir. En az 3800xg hızında santrifüj işleminden sonra, yoğunlaştırılmış örneğin sitosantrifüj ile yeniden çevrilmesiyle elde edilen sedimentte basilin görülme oranı artmaktadır.
ELEKTROMANYETİK İŞARETLEME TEKNİĞİ
M. tuberculosis’ e özgül antikorlarla kaplı manyetik polystrene kürecikler örneğe ilave edilmekte, örnekteki basiller bu küreciklere yapışmakta ve basiller fluoresans mikroskopla görülebilmektedir. Duyarlılığı önemli oranda yükselten bu metod henüz günlük kullanıma girmemiş, araştırma düzeyinde kalmıştır.
COMPUTER-DİRECTED OTOMOTİZE MİKROSKOP
Henüz deneme aşamasında olan bilgisayar destekli bir mikroskop türüdür.
LYSIS-CENTRIFUGATİON SYSTEM (Isolator System)
(Shandon Instruments, Sewickley, PA)
Özellikle kandan mikobakteri üretimi için uygun bir sistemdir. Saponin, EDTA, SPS, fluorinert, polypropylenglycol içeren besiyerinin bulunduğu bir tüpe kan alınır. Kan hücreleri erir. Amaç intrasellüler basilleri açığa çıkarmaktır. Santrifüjlenen tüpün sedimenti uygun besiyerine ekilir. Özellikle immun sistemi baskılanmış hastalardan MAC izolasyonu için önerilen bir sistemdir.
GELENEKSEL KÜLTÜR YÖNTEMLERİ
Geleneksel kültür yöntemleri yumurta bazlı (Löwenstein-Jensen ( L-J ), Petragnani, vs); agar bazlı (Middlebrook 7H10, vs ); likid ( Kirchner, vs ) ve selektif media ( L-J Gruft modifikasyonu, Mitchison ) olabilir.
Tüm bu besiyerlerine ekim yapıldıktan sonra % 5 – 10 CO2 içeren ortamda inkübe edilmeleri üreme şansını arttırır. Mikobakteri yavaş ürer. Optimal koşullarda diğer bakterilerde 40 – 60 dakika olan üreme zamanı mikobakterilerde 20 – 22 saattir. Bu besiyerlerinde üreme süresi 6 – 8 haftadır. Örnekte ARB pozitif bulunmuş ve 8 hafta sonra üreme henüz saptanmamışsa ek bir 8 hafta inkübasyona devam edilmesi önerilmektedir.
Geleneksel kültür yöntemleri ile tanı koymak oldukça zaman kaybettirici olduğundan dolayı tüberküloz basilinin varlığını kısa sürede saptamaya yönelik, duyarlılığı yüksek yöntemlerin geliştirilmesinde farklı yaklaşımlar denenmekte ve çeşitli yöntemler geliştirilmektedir. Bu yaklaşımlar aşağıda sıralanan belli başlıklar altında toplanabilir:
1 – Hızlı sonuç veren kültür sistemleri
2 – Serolojik yöntemler
3 – Çeşitli hücrelerden salınan enzimlerin belirlenmesi
4 – Moleküler tanı yöntemleri
HIZLI KÜLTÜR YÖNTEMLERİ
BACTEC 460 TB Sistemi
Septi-Chek MB sistemi
MB – Bac T Mikobakteri tesbit sistemi
Mycobacteria Growth İndikatör Tube (MGIT)
MB Redox
ESP ( Extra Sensing Power ) Culture System II
BACTEC 960 TB Sistemi
BACTEC 9000 MB
BACTEC 460 TB
(BectonDickinson Diagnostic Intruments Systems, Sparks, MD)
Middlebrook 7H12 sıvı besiyeri ve 14 C işaretli palmitik asit içeren radiometrik bir sistemdir. Ortama ekilen materyal içinde mikobakteri var ise üreme esnasında metabolizması sonucu radyoaktif CO2 oluşur . Oluşan radyoaktif CO2 gazını saptayan okuyucu üremenin belirlenmesini sağlar ve Growth Index (GI) olarak değer belirlenir. Ortalama üreme süresi 10 – 12 gündür. ARB pozitif örneklerde bu süre iki güne kadar inebilir. Bu sistemin bir diğer avantajı sadece bu sistem için uyarlanmış tip idantifikasyon sisteminin (p-nitro-alfa-acetylaminobeta-hydroxypropiophenone; NAP) bulunması; deoxyribonucleic acid (DNA) probe, PCR-RFLP gibi sistemlerle idantifikasyona uygun olması ve antibiotik hassasiyet testlerinin yapılabilmesidir. Yapılan çalışmalarda duyarlılık Mikobakteriler için % 84 - 99.4; M. tuberculosis complex için % 91 – 100 arasında bulunmuştur.
Diagnostik amaçlı ve direnç çalışması için FDA onayı vardır.
Yapılan çalışmalarda mikobakteri tanısı için başka ticari sistemlerde bulunmuştur. Bunlar ile ilgili çalışmalar BACTEC Sistemine alternatif olabilecekleri konusunda umut vermekle birlikte henüz yeterince değerlendirilmemişlerdir.
Septi-Check (Septi-Check AFB, Becton Dickinson, Sparks, MD)
Sıvı ve katı besiyerlerini birlikte içeren bifazik bir sistemdir. Üreme süresi BACTEC kadar hızlı değildir. Ortalama 20 günde üreme saptanır. Kapasitesi az olan laboratuvarlar için önerilebilir. Çalışmalarda duyarlılık % 80 – 95 arasında bulunmuştur.
MB/Bac T Alert (Organon Teknica, Durham, NC)
Bu sistem Middlebrook 7H9 besiyeri içerir. Şişenin dibinde CO 2 üretimine duyarlı bir sensor vardır. Ortamda mikobakteri varsa sarı-yeşil renk değişimi olur. Avantajı kolorimetrik, tam otomatik, non radyometrik ve kapalı bir sistem olmasıdır. Ortalama üreme süresi 15 – 20 gündür. Yapılan bir çalışmada duyarlılık mikobakteriler için % 78.8 - 80; M. tuberculosis complex için % 84.5 – 91.3 bulunmuştur.
MGIT tube system (Becton Dickinson, Sparks, MD)
Besiyeri olarak Middlebrook 7H9 içerir. Şişenin dibinde silikona gömülü olarak oksijen tüketimine duyarlı flouresans bir madde bulunur. Mikobakteri üremesi olur ise oksijen tüketimine bağlı olarak bu madde ultraviyole lambasında sarı bir renk verir. Nonradyoaktif bir sistemdir, otomatik veya manuel okuma yapılabilir. Ortalama üreme süresi 12 – 13 gündür. Bu sistemin avantajları BACTEC gibi tip idantifikasyonu için deoxyribonucleic acid (DNA) probe, PCR-RFLP gibi sistemlerin kullanılabilmesi ve antibiotik hassasiyet testlerinin yapılabilmesidir. Fakat BACTEC gibi özel bir idantifikasyon sistemi yoktur. Duyarlılık oranları BACTEC sistemine yakındır ancak kontaminasyon oranının BACTEC’ den daha yüksek olması en büyük dezavantajıdır.
Maliyeti BACTEC sistemine yakındır. NTM için iyi bir seçenektir.
MB Redox (Heipna Diagnostika)
Manuel kültür sistemidir. Modifiye Kirchner medium içerir. Ayrıca üreme olduğu zaman redüklenerek renkli hale geçen bir redox indikatör ve renksiz tetrazolium tuzu eklenmiştir. Üreme olduğu zaman toplu iğne başı büyüklüğünde, pembe partiküller gözle görülebilir. Sadece üremeyi tespit eder. Okuma için cihaz gerektirmez ama M. tuberculosis complex’ i diğer mikobakterilerden ayırt etmez. Diğer idantifikasyon testleri için kullanılabilir. Ancak antibiotik testleri yapılamaz. Çalışmalarda duyarlılık % 69 - 87 arasında bulunmuştur. Ortalama üreme süresi 15 – 19 gün olarak saptanmıştır.
ESP (Extra Sensing Power) Culture System II
(AccuMed International, Westlake, Ohio)
ESP II Blood Culture System ’ inin bir modifikasyonudur. Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri içerir. Otomatik ve oksijen tüketimine duyarlı bir sistemdir. Üreme sonucu mikobakterilerin metabolik aktivitesi sonucu tüketilen oksijenin oluşturduğu basınç değişikliğinin devamlı monitorize edilmesi prensibi ile çalışan bir sistemdir. Non radyometriktir. Yapılan bir çalışmada duyarlılık % 79 bulunmuştur. MAC için iyi bir seçenektir. Ortalama üreme süresi 18 gündür. Rutin uygulamaya girmemiştir.
Duyarlılık testi için FDA onayı olan tek non-radyometrik sistemdir.
BACTEC 9000 MB (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md.)
Oksijen tüketimine duyarlı floresans madde içeren bir sistemdir. Üreme süresi BACTEC 460 ve MGIT ile benzerdir. Otomotize ve non-radyoaktiftir. Kan örnekleri direkt olarak ekilebilir.
BACTEC 960; BACTEC 460’ ın otomatize bir versiyonudur.
Hızlı Kültür Yöntemlerinin Avantajları
Hızlı kültür yöntemleri, geleneksel kültür yöntemlerine göre daha kısa sürede sonuç vermektedir. Ancak moleküler tanıya dayalı hızlı tanı yöntemlerine göre daha geç sonuçlanmaktadır. Buna karşın kültür, bakterilerin canlılığını doğrudan göstermesi, çoğaltılan suşun daha sonraki inceleme ve araştırmalar için saklanabilmesi ve direnç testlerinin yapılabilmesi, duyarlılığının daha yüksek olması açısından çok önemlidir. Diğer hızlı sistemlerle tüberküloz tanısı konsa dahi mutlaka kültür yapılarak bakteri üretilmeye çalışılmalıdır.
Bakterinin kültürde üretilebilmesi için 10-100 basil / ml konsantrasyonunda olması gerektiği unutulmamalıdır.
ÇEŞİTLİ HÜCRELERDEN SALGILANAN ENZİMLERİN BELİRLENMESİ
Adenozin deaminaz (ADA)
Pürin metabolizmasında işlevi olan bir enzimdir. Özellikle plevra, periton, perikart ve BOS gibi sıvılarda, bu boşluklarda tüberküloz bulunduğu zaman ADA düzeyi yüksek olarak saptanabilir. Bu boşluklara ait malignensilerde de ADA düzeyi yüksek bulunabilmekle beraber, yükseklik genellikle tüberkülozdaki kadar belirgin değildir. Yapılan çalışmalarda plevral sıvı için duyarlılık % 55 - 90 özgüllük % 55 – 89 olarak saptanmıştır.
İnterferon- gama
Plevra sıvısında 200 pg / ml üzerindeki IFN gama düzeyinin, uyumlu bir klinik tablo ile tanıda önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Çalışmalar IFN gama ile ADA’ nın tüberküloz plörezi tanısında benzer değere sahip olduğunu göstermiştir. Ancak kesin tanıda yeri henüz kesinleşmemiştir.
Lizozim
Lizozimin tüberküloz plörezi olgularında plevral sıvıda belirgin bir şekilde arttığı ve bunun da tanıda yararlı olabileceği gösterilmiştir. Ancak ADA ve IFN gama ile karşılaştırıldığında daha düşük tanı değerine sahip olduğu görülmüştür.
İnterlökin-1Beta; İnterlökin-2; İnterlökin-8; Tümör Nekrotizan Faktör-a ile ilgili çalışmalarda da; plevral sıvıda IFN gama ve ADA ile özellikle TNF-a ve IL-1 beta’ nın korelasyon gösterdiklerine dikkat çekilmiştir. Ancak bu sitokinlerle ilgili çalışmalar henüz yeterli değildir.
MİKOBAKTERİ ÜRÜNLERİNİ SAPTAYAN METODLAR
Tüberkülostearik asit (TSA) saptanarak özellikle BOS ve balgam’ da tüberkülozun tanısı mümkündür. Bu sistem için mass spektroskopi ve gaz likid kromotografi gerekmektedir. Bu nedenle pahalı bir tekniktir ve geniş kullanım alanı bulamamıştır.
TSA' nın nontüberküloz mikobakteri ve aktinomisetlerde de bulunuşu tekniğin günlük pratiğe girmesine engel olmuştur.
SEROLOJİK TANI
Serolojik yöntemler aslında tüberküloz tanısı için kullanılmaya başlanan en eski yöntemlerdendir. Ancak çevrede yaygın olarak bulunan M. tuberculosis complex dışındaki mikobakterilerin çapraz tepkimeye yol açan antijenleri nedeniyle duyarlılık ve özgüllük sorunlarının çözülemeyişi günlük pratiğe girmesine engel olmuştur. 1972 yılında enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) yönteminin tanımlanması ile serolojik tanıda dramatik bir değişim oldu. Zamanla M. tuberculosis’ te bulunan antijenlerin saflaştırılabilmesi, bu antijenleri özgül olarak tanıyan monoklonal antikorların elde edilebilmesi serolojik tanıyı tekrardan gündeme getirmiştir. Duyarlılık ve özgüllük çalışılan yönteme ve aranan antijen veya antikora göre değişmektedir. Yapılan çalışmalarda antikor aranmasında duyarlılık % 24 – 100; antijen aranmasında duyarlılık % 39 - 94.4 arasında bulunmuştur. Bu testlerin özgüllüğü ise tek özgül epitopa antikor yanıtı arandığında % 100 e yaklaşmaktadır. Ancak genellikle olumlu sonuçlar, hastalığın ileri devrelerinde elde edilmektedir. Bu nedenle günümüzde ancak klasik yöntemlere yardımcı bir test olarak kullanılabilirler. Serolojik yöntemlerin özgüllüğünü düşürmeden duyarlılığını arttırmaya yönelik çalışmalar devam etmektedir.
MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Tüberküloz tedavisinin hızlı bir biçimde uygulanmasının, gerek hasta birey, gerekse çevre sağlığı açısından önemi büyüktür. Fakat, mikobakterilerin in vitro ortamlarda yavaş üreme özelliği, tanının ve dolayısı ile uygun tedavi uygulamasının gecikmesine neden olur. Bu sebeple, son yıllarda yapılan çalışmalarda hızlı tanı yöntemlerinin geliştirilmesi hedef alınmıştır. 1985 yılında, Mullis ve ark. tarafından tanımlanan polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction-PCR) yöntemi, bu konuda yapılan çalışmalarda yeni bir ufuk açmıştır.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Yöntem; nükleik asitlerin istenilen bölgelerinin, bölgeye özel, sentetik oligonükleotid primerleri kullanılarak, in vitro ortamda kopyalanmasını esas alır. Hedef olarak rRNA veya genomik DNA’nın ayırıcı özellik taşıyan farklı bölgeleri kullanılabilir. Kopyalama işlemi kısa sürer. Bu büyük bir avantajdır. Yöntemin bir diğer avantajı, az miktarlarda (picogram (pg) seviyesinde) hedef molekül olduğu hallerde dahi sonuca gidebilmektir. PCR için, mililitrede 10 basil bulunması tanı için yeterli olmaktadır. Burada en önemli faktör, DNA kontaminasyonudur. DNA dayanıklı bir moleküldür. Laboratuvar uygulamaları sırasında aerosol ile reaksiyona girerek, yalancı pozitiflik yaratabilir. Bununla birlikte, çalışılan materyalin türüne göre, PCR’ın inhibe olması söz konusu olabilir ki bu da yalancı negatif sonuçların ortaya çıkmasına neden olur.Yapılan çalışmalar, doğrudan PCR uygulaması kullanıldığı takdirde yalancı negatiflik ve pozitiflik oranlarının yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Sonuçlar klinik bulgular ve diğer laboratuvar yöntemleri ile bir arada değerlendirilmelidir.
PCR’da kontaminasyon riskini ortadan kaldırabilmek ve moleküler çalışmalarda duyarlılık yüzdelerini arttırabilmek amacı ile yeni yöntemler geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla in house sistemlerden sonra ticari sistemler de geliştirilmiştir. Ticari sistemlerin kontaminasyon riskinin daha az olması, miktarzbelirlenebilmesi, daha duyarlı olması ve otomatizasyon kapasitelerinin olması gibi avantajları vardır. Bu sistemler şunlardır:
• Nükleik Asid Amplifikasyon Yöntemi
Amplified M tuberculosis Direct Test (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA)
AMPLICOR M tuberculosis Test (Roche Diagnostic Systems, Inc., Indianapolis, IN)
• SDA (strand displacement amplification)
(Becton-Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD)
• LCR (ligase chain reaction)
(Abbott Park, IL)
• Q beta replicase
(Downers Grove, IL)
Bu metodlar hızlı ve özgüldür. Ancak, örnekte sadece M. tuberculosis complex varlığını saptar. Nontüberküloz mikobakterilerin varlığını saptamak, canlı bakteri varlığını ayırt edebilmek ve hassasiyet testlerini çalışabilmek için hala kültür yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bu ticari kitlerden smear pozitif pulmoner örnekler için MTDT ve Amplicor M tuberculosis Test; smear negatif pulmoner örnekler için ise sadece MTDT’ nin Food and Drug Administration (FDA) onayı bulunmaktadır.
Mycobacterium Tuberculosis Direct Test (MTDT) (Gen-Probe Inc., San Diego, CA)
MTD testi trancription-mediated amplification (TMA) sistemi ile çalışır. Hedef 16s ribosomal RNA(rRNA)’dır. Sistem isotermaldir. Bir mikobakteri içinde de 2000' in üzerinde rRNA bulunur. Bu nedenle, 1 basil/ml olması tanı için yeterlidir. Testin duyarlılığı yüksektir. Tüm işlemin tek bir tüpte olması kontaminasyon riskini azaltır. Hedef rRNA olduğu ve RNA dış ortamda DNA’ dan daha labil olduğu için cross kontaminasyon riski de azdır. Yalancı negatiflik ve pozitiflik oranı PCR’ dan düşüktür. 5 saatte sonuçlanır.
Amplicor M. tuberculosis Test (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ)
Amplicor M. tuberculosis test, PCR sistemi ile çalışır. Hedef , genomdaki rRNA genidir. Hedef DNA olduğu için kontaminasyon riski daha çoktur ve ml’ de birden fazla basil bulunmasına ihtiyaç duyar. 6-7 saatte sonuçlanır.
Q – Beta Replicase Assay (Vysis, Downers Grove IL)
Q – Beta Replicase Assay sistemi, hedef alınan 23s rRNA’ nın yakalanması ve Q beta replicase enzimiyle birlikte çoğalabilen bir probun amplifikasyonu esasına dayanır. Balgamda yapılan bir çalışmada inhibisyona rastlanmayışı PCR’ a göre bir üstünlüktür.
Ligase Chain Reaction Test (Abbott Laboratories Diagnostic Division, Abbott Park, IL)
LCR, iki küçük DNA primeri ve onları birleştiren ligaz enzimi kullanarak, DNA kopyalarını hızla oluşturmak için geliştirilmiş bir sistemdir. PCR’a göre daha özgüldür ve otomatik saptama sistemi vardır. Kontaminasyon kontrol sisteminin olmayışı dezavantajıdır. LCR ile örnekte 7-8 bakteri/ml bulunması pozitif sonuç almak için yeterlidir.
Strand Displacement Amplification (SDA)
SDA yöntemi PCR’a benzer. İzotermal bir amplifikasyon metodudur. Yöntemin özgüllüğü aranan etkene özgü DNA dizilerini tanıyacak primerlerin kullanılmasına bağlıdır. 10 basil/ml den az mikobakteri tanı için yeterlidir.
LUSİFERASE REPORTER PHAGES ( Biotec Laboratories Ltd, Ipswic )
Umut verici bir yöntem de Jacobs ve ark. (1993) tarafından açıklanmıştır. Lusiferase Reporter Phages yöntemi adı verilen bu yöntemde prensip ateş böceğinin ışık salmasından sorumlu lusiferaz enzimini kodlayan geni içeren bakteriofajları materyale ekleyerek canlı mikobakterileri tespit etmektir. Bakteriofajlar, ortamda canlı mikobakteri varsa mikobakteri ile birlikte çoğalırlar ve lusiferaz enzimi de çoğalır. Işık veren hücreler fotometre ile tespit edilir. Örnekte 500-5000 basil/ml olması tanı için yeterlidir. Yaklaşık 4 saatte sonuç alınabilmesi en önemli avantajıdır.
TÜR TAYİNİ METODLARI
• Konvansiyonel Metodlar
• Immünolojik Yöntemler
• DNA probları ve Hibridizasyon
• Bactec NAP testi
• High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
• Gaz Likid Kromatografisi (GLC)
• PCR – RFLP
• LİPA MYCOBACTERiA Test
• DNA sequencing Sistemi
• Mycobacterium tuberculosis’ in moleküler tiplendirmesi
• DNA Chip Teknolojisi
Konvansiyonel İdantifikasyon Metodu
Nitrat redüktaz, katalaz, tween hidroliz gibi testlerin çalışılması gerekir ve 2-3 hafta gibi uzun süreye ihtiyaç vardır. Bu nedenle rutinde kullanılmamaktadır.
Immünolojik Yöntemler
Tür tayininde M tuberculosis complex, M avium-intracellulare, M kansasii’ ye ait monoklonal antikorlar kullanılarak ELİSA ile de tür tayini yapılabilmektedir.
Rutinde kullanılmamaktadır.
DNA Probları ve Hibridizasyon
Mikobakteri genomuna özel DNA parçaları hedef mikobakteri rRNA’ sını saptamada prob olarak kullanılabilir. Ortamda hedeflenen rRNA varsa, uygun koşullarda DNA probu hedef RNA ile birleşir. Bu olaya hibridizasyon denir. Kullanılan problar bir markerla işaretlenmiştir. Oluşan hibridler bu sayede saptanabilir. Problar ile tür tayini yapabilmek için 1000 - 10000 basil/ml olması gerekmektedir. Bu nedenle kültürde üremiş mikobakteriler için uygundur ve tip tayini iki saat gibi kısa sürede mümkün olmaktadır. Ancak pahalı bir yöntemdir ve az sayıda mikobakteriyi isimlendirebilir. Sonuçların kültür ve biyokimyasal tekniklerle konfirme edilmesini öneren yayınlar vardır. Yöntemin duyarlılığını arttırmak için ‘ dallanan DNA sinyal arttırma sistemi’
adı verilen yeni bir teknik geliştirilmeye çalışılmaktadır. Bu teknik ile duyarlılığın en az 100 kez arttırılabileceği düşünülmektedir.
Ticari olarak bulunan problar şunlardır:
Accuprobes (GenProbe, Inc., san Diego, CA)
BDProbe Tec ET system (Becton-Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD)
DDH Mycobacteria (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Tokyo, Japan)
BACTEC NAP Testi
NAP; kloramfenikol sentezinde bir ara üründür. M. tuberculosis complex’ teki mikobakterilerin üremesini inhibe eder. Diğer mikobakterileri etkilemez. BACTEC’ te üremiş olan mikobakteri içinde NAP diski bulunan özel şişeye ve kontrol şişesine eşit oranda eklenir ve cihaz ile growth index (GI) yükselmesi takip edilir. Üreyen mikobakteri M tuberculosis complex ise NAP bulunan şişede GI yükselmesi olmayacak veya diğer şişeye oranla daha az yükselecektir. Ortalama 5 günde sonuçlanır. Bu yöntem ile M. tuberculosis complex ile Atipik Mikobakteri ayrımı yapılabilir. Atipik mikobakteriler isimlendirilemez.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Hücre duvarındaki uzun zincirli yağ asidi (mikolik asid) tespitine dayalı bir yöntemdir. Bu yöntem ile 75 mikobakteri isimlendirilebilir. En önemlisakıncası kullanılan aletlerin çok pahalı olmasıdır. M.tuberculosis complex içindeki mikobakterileri idantifiye etmek için de kullanılan bir yöntemdir.
Gaz Likid Kromatografisi (GLC)
Mikobakteri hücre duvarındaki kısa zincirli yağ asitleri saptanması ile iki saat kadar kısa bir sürede 29 mikobakterinin tip ayrımını sağlar. Pahalı bir yöntemdir.
Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR – RFLP)
Bu metodun prensibi mikobakterilerde ortak olarak bulunan hedef bölgesinin PCR yöntemi ile çoğaltılması, daha sonra restriksiyon enzimleri kullanılarak bu çoğaltılan gen bölgesinin kesilmesi ve uygun jel matriksinde elektroforez uygulaması yapılarak, pattern farklılıklarının saptanması ile tip tayininin yapılmasıdır. Hedef hsp65, rpoB, dnaJ, 16S rRNA, 16S-23S DNA gen bölgeleri olabilir. In-house PCR’ da rutin kullanılan 65kDa HSP’ yi kodlayan gen bölgesidir. Bu yöntemle 75 ‘ e yakın mikobakteri tür seviyesinde isimlendirilebilir. 1 günde sonuçlanır. Diğer yöntemlerden daha ucuz ve güvenilir bir yöntemdir.
Lipa Mycobacteria Test
PCR için hedef 16-23S rRNA bölgesidir. PCR ve gel elektroforezden sonra 3 saat içinde sonuçlanır. Major avantajı birden fazla Mikobakteri çeşidinin varlığını tespit edebilmesidir.
( Innogenetics NV, Ghent, Belgium )
MicroSeq 500 System
PCR için hedef 16S rRNA bölgesidir. PCR ve gel elektroforezden sonra 4 saat içinde sonuçlanır.
(PE Applied Biosystems)
DNA Sequencing Sistemi
Son yıllarda en yaygın kullanım alanı bulan metotlardandır. Mikobakterilerde 16s rRNA içerisinde, cinse özgü bölgelerle birlikte türe özgü özellikler gösteren oldukça değişken bölgeler bir arada bulunmaktadır. 16S rRNA’ yı kodlayan DNA bölgesi, PCR ile çoğaltılır ve bu bölgenin dizisi saptanarak bilgisayar yardımıyla tip tayini yapılır. Özel bir sistem gerektirmektedir ve pahalı bir yöntemdir. 2 günde sonuçlanabilir.
DNA Chip Teknolojisi
Moleküler biyoloji ile bilgisayar teknolojisi birleştiren bir sistemdir.
DİRENÇ TAYİN YÖNTEMLERİ
Tüberküloz hassasiyet testlerinin M. tuberculosis complex saptanmış; daha önceden tedavi görmemiş veya tedavinin ikinci ayında hala kültür veya smear sonucu pozitif olan tüm hastalara yapılması önerilmektedir.
Geleneksel Direnç Tayin Yöntemleri
Bu metodlar ile sonuç alabilmek için 14 – 21 güne ihtiyaç vardır.
Radyometrik Yöntem (BACTEC)
Yapılan çeşitli düzenlemeler ve 10 yılı aşkın süredir klinik kullanımı bu testi hızlı ve güvenilir bir yöntem durumuna getirmiştir. NCCLS tarafından standart bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Geleneksel yöntemlerden daha pahalıdır ancak 4 – 7 günde sonuçlanması geleneksel yönteme en büyük üstünlüğüdür. Bu yöntem major ilaçlar (izoniazid, rifampin, etambutol, pirazinamid, streptomisin) dışında kanamisin, kapreomisin, rifabutin, siprofloksasin gibi minor ilaçlar içinde uygun bir sistemdir.
MGIT
Klinik örneklerden mikobakteri izolasyonunu gerçekleştiren hızlı ve duyarlı yöntemlerden biridir. 5-6 günde sonuçlanabilir. Kontaminasyon oranı yüksek ve geleneksel yöntemlerden pahalı bir yöntemdir.
Moleküler Yöntemler
M. tuberculosis suşlarında çeşitli antimikobakteriyel ajanlara direnç, o ilaçların bağlandığı hedef bölgeleri kodlayan genlerde oluşan mutasyonlarla ilişkilidir. Örneğin, rifampisin direncinden, ilacın bağlandığı RNA polimerazın B subunitini kodlayan rpo B genindeki mutasyonlar sorumludur. Moleküler tekniklerle bu mutasyonların gösterilmesi amaçlanmaktadır. Bu yöntemler ile süre çok kısalabilmektedir. Ancak henüz tüm ilaçlar için uygulanamamaktadır ve rutinde kullanılmamaktadır. Çalışmalar devam etmektedir. Ayrıca pahalı yöntemlerdir.
Tüberkülozun etkin şekilde kontrolü ile başarılı tedavi için erken tanı yöntemleri ile hızlı duyarlılık testlerine gereksinim duyulmaktadır. Gerek kültüre veya bakteri varlığına dayalı gerekse her geçen gün yenileri eklenen moleküler tekniklerle bu gereksinimler karşılanmaya çalışılmaktadır. Ancak sözü edilen tüm yöntemlerin bazı avantajları bulunmakla birlikte en hızlı ve en güvenilir olana ulaşmak amacı ile halen yoğun çalışmalar yapılmaktadır.
TÜBERKÜLOZ MAJOR İLAÇ REZİSTANS ÇALIŞMASININ KAPSAMI
• Streptomisin
• Rifampisin
• Pirazinamid
• INH
• Etambutol
TÜBERKÜLOZ MİNÖR İLAÇ REZİSTANS ÇALIŞMASININ KAPSAMI
• Kapreomisin
• Etionamid
• Ofloksasin
• Klofazimin
• Kanamisin
• Rifabutin
• PAS
KAYNAKLAR
• Samra Z et al. Comparative study of three culture systems for optimal recovery of mycobacteria from different clinical specimens. Abstr Gen Meet Am Soc Microbiol 1999: 99: 133.
• Piersimoni C. Scarparo C et al. Multicenter evaluation of the MB – Redox medium compared with radiometric BACTEC system, mycobacteria growth indicator tube ( MGIT ), and Lowenstein – Jensen medium for detection and recovery of acid-fast bacilli. Diagn Microbiol Infect Dis 1999: Aug: 293-299.
• Piersimoni C. Scarparo C et al. Comparison of MB/BacT ALERT 3 D system with radiometric BACTEC system and Lowenstein – Jensen medium for recovery and idantification of Mycobacteria from clinical specimens. J Clin Microbiol 2001: February: 651-657.
• Tortoli E . Cichero P et al. Multicenter comparison of ESP Culture System II with BACTEC 460TB and with Lowenstein – Jensen medium from different clinical specimens, including blood. J Clin Microbiol 1998: May: 1378-1381.
• Somoskovi A. Kodmon C et al. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, BACTEC 460TB system, and Lowenstein – Jensen medium. J Clin Microbiol 2000: June: 2395-2397.
• Rusch-Gerdes S. Ebrahimzadeh A et al. Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960 system compared to the BACTEC 460TB system and solid media for recovery of mycobacteria. Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology 1998.
• Sturm A W. Roux L. Evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for growth and detection of mycobacteria in human clinical samples. Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology 1998.
• Heifets L. Linder T et al. Two liquid medium systems, mycobacteria growth indicator tube and MB Redox tube, for Mycobacterium tuberculosis isolation from sputum specimens. J Clin Microbiol 2000: Mar: 1227-1230.
• Saniç A. Çoban A Y. Mikobakteriler ve Laboratuvar Tanı . Samsun, Ondokuz Mayıs Üniversitesi, 1999: 1-6, 38-39, 47-49, 62-69, 79-87.
• Kocagöz T. Yeni laboratuvar yöntemleri ile tüberküloz tanısı. İnf Derg 1997: Ekim: 29-33.
• Yüce A. Mikobakterilerde antibiotik duyarlılık testleri. İnf Derg 1997: Ekim: 47-51.
• Öztürk R. Tüberküloz tanısında yenilikler. 8. Türk Klin Mikrobiyol ve İnf Hast Kong. 1997: 108-120.
• Akcan Y. Tuncer S. Tüberküloz tanısında yeni laboratuvar yöntemleri. Flora Derg 1997: 4: 262-266.
• Esteban J. Fernandez-Roblas R et al. Usefulness of BACTEC MYCO/F lytic system for detection of mycobacteria in clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods 2000: Mar: 63-66.
• Gamboa F. De la Rosa Z et al. Negative effect of the components of the lysis-centrifugation system in growth of mycobacteria in MGIT and Septi-Check AFB liquid media. Enferm Infecc Microbiol Clin 2000: Nov18(9): 439-444.
• Collins C H. Grange J M. Yates M D. Tuberculosis Bacteriology: Organization and Practice. Oxford, Butterworth-Heinemann, 1997:1-4, 48-57, 84-86, 110-116.
• Zheng X. Robert G D. Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial Infections: Diagnosis and susceptibility testing. Schlossberg D, Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1997: 57-64.
• Gail L. Woods MD. The Mycobacteriology Labratory and New Dıagnostic Techniques. Infect. Disease Clinics of North America 2002: March 16(1).
• Somoskovi A, Mester J. Laboratory Diagnosis of Nontuberculous Mycobacteria. Clinics in Chest Medicine 2002: September 23(3).
|
